李建新 鄧全紅 朱文 劉波 沈旭

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，且腎癌的發(fā)病率不斷升高。腎癌的主要治療方式為手術(shù)治療，但較高的復(fù)發(fā)率和早期轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[1]。尋找一種可早期診斷腎癌的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶標(biāo)，對(duì)腎癌的臨床治療具有重要的意義。微小RNAs(miRNAs)是一種存在于真核生物的非編碼RNA，是長(zhǎng)度僅為18～25 nt的小分子單鏈RNA[2]。miRNAs既可作為一種癌基因，也可作為一種抑癌基因[3]。miRNAs的異常表達(dá)可促進(jìn)腎癌的惡性發(fā)展，眾多miRNA被證實(shí)與腎癌的病理過(guò)程顯著相關(guān)[4]。本研究對(duì)腎癌組織中多個(gè)miRNA的表達(dá)進(jìn)行了篩選分析，發(fā)現(xiàn)miR-3915在腎癌組織中異常表達(dá)。miR-3915是一種未見(jiàn)研究報(bào)道的miRNA，故本研究以miR-3915為研究對(duì)象，觀察進(jìn)一步下調(diào)miR-3915的表達(dá)后其對(duì)腎癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，并通過(guò)生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，探討了miR-3915的作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

14例腎癌及癌旁組織標(biāo)本來(lái)自我院泌尿外科，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。人正常腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)和腎癌癌細(xì)胞株(A498、OS-RC-2、ACHN、786-O)購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；miR-3915模擬物、miR-3915抑制序列(3′-AACTCCTTTTCTACCAGAATAA-5′)、陰性對(duì)照序列(miR-NC)、野生型pGenesil-1.1-CMTM3質(zhì)粒(CMTM3-WT)、突變型pGenesil-1.1-CMTM3質(zhì)粒(CMTM3-MUT)購(gòu)自上海GenePharma公司；DMEM高糖培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PCR試劑盒購(gòu)自寶生物(大連)公司；Trizol試劑和Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；CMTM3、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Slug和β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；引物購(gòu)自上海生工生物工程公司；24孔板Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

細(xì)胞的培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，正常腎小管上皮細(xì)胞株HK-2在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)，腎癌細(xì)胞株A498、OS-RC-2、ACHN、786-O在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。將A498細(xì)胞接種于6孔板，待培養(yǎng)至60%～70%，根據(jù)Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染miR-3915抑制序列組命名為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列(miR-NC)組命名為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后24 h更換為新鮮培養(yǎng)液。

三、RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)

Trizol法提取組織和細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，利用PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)。miR-3915正向引物為5′-GGGGATGTTGAGGAAAAGATGGT-3′，反向引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物為5′-TCCGATCGTGAA-GCGTTC-3′，反向引物為5′-GTGCAGGGTCCG-AGGT-3′；GAPDH正向引物為5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物為5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′；CMTM3正向引物為5′-CGGCCCTCATCTACTTTGCTA-3′，反向引物為5′-GCCACGTCGTTAAAGATCAGGT-3′。以U6 RNA作為內(nèi)參檢測(cè)miR-3915的表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參檢測(cè)CMTM3的表達(dá)水平，采用2-△△Ct法分析miR-3915在腎癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)量。

四、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件MicroT-CDS和miRanda預(yù)測(cè)顯示，CMTM3基因3′UTR含有miR-3915的結(jié)合序列(圖1)。將miR-3915或miR-NC和CMTM3-WT、CMTM3-MUT共轉(zhuǎn)染至A498細(xì)胞，分組為miR-3915+CMTM3-WT、miR-NC+CMTM3-WT、miR-3915+CMTM3-MUT和miR-NC+CMTM3-MUT，連續(xù)培養(yǎng)48 h。以海腎熒光素酶熒光值作為對(duì)照，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒分析A498細(xì)胞的熒光素酶活性。

圖1 miR-3915與CMTM3基因互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域

五、Western blot

轉(zhuǎn)染48 h后，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞3次，采用蛋白裂解液裂解并提取細(xì)胞總蛋白，兩組取等量蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的脫脂牛奶室溫下封閉2 h，三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBST溶液)洗膜后，分別與一抗CMTM3、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Slug和β-actin在4 ℃孵育12 h。TBST溶液洗膜后，與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育3 h，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑在凝膠成像系統(tǒng)中顯影，拍照并分析。

六、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

轉(zhuǎn)染48 h后，將兩組A498細(xì)胞胰酶消化后，采用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸，200 μl/孔接種至24孔板Transwell上室，下室加入600 μl完全培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)24 h。取出上室，甲醛固定后，用棉簽擦去未遷移的細(xì)胞，結(jié)晶紫溶液染色，流水洗去多余染液。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取6個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)并取平均值。

七、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

轉(zhuǎn)染48 h后，將基質(zhì)膠預(yù)鋪在24孔板Transwell上室，培養(yǎng)箱內(nèi)風(fēng)干4 h后取出。將兩組A498細(xì)胞胰酶消化后，采用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸，200 μl/孔接種至24孔板Transwell上室，下室加入600 μl完全培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)24 h。取出上室，甲醛固定后用棉簽擦去未侵襲的細(xì)胞和基質(zhì)膠，結(jié)晶紫溶液染色，流水洗去多余染液。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取6個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)并取平均值。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、腎癌組織和腎癌細(xì)胞株中miR-3915表達(dá)上調(diào)

相對(duì)于癌旁組織，14例配對(duì)腎癌組織中miR-3915的表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。見(jiàn)圖2。相對(duì)于正常腎小管上皮細(xì)胞，miR-3915在腎癌細(xì)胞株中的表達(dá)均增加(P<0.05)，其中A498細(xì)胞中增加最明顯(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

二、miR-3915抑制序列對(duì)A498細(xì)胞中miR-3915表達(dá)的影響

miRNA-3915抑制序列和陰性對(duì)照序列miR-NC轉(zhuǎn)染A498細(xì)胞，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組A498細(xì)胞中miR-3915表達(dá)顯著降低[(1.01±0.06)∶(0.21±0.03)，P<0.01]。見(jiàn)圖4。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)腎癌組織中miR-3915的表達(dá)(與癌旁組織比較**P<0.01)

圖3 qRT-PCR檢測(cè)正常腎小管上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞中miR-3915的表達(dá)(與HK-2比較*P<0.05；**P<0.01)

圖4 qRT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞中miR-3915的表達(dá)(與對(duì)照組比較**P<0.01)

三、miR-3915對(duì)CMTM3基因的結(jié)合作用驗(yàn)證

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-3915和CMTM3-WT共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性明顯低于miR-NC和CMTM3-WT共轉(zhuǎn)染(P<0.01)；miR-3915或miR-NC和CMTM3-MUT共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

四、轉(zhuǎn)染miR-3915抑制序列對(duì)CMTM3基因表達(dá)的影響

qRT-PCR顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CMTM3 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)[(1.00±0.11)∶(4.83±1.32)，P<0.01]。Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-3915抑制序列后，CMTM3、E-cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)升高，Vimentin和Slug蛋白表達(dá)降低。見(jiàn)圖6。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-3915對(duì)CMTM3的結(jié)合作用(與miR-NC比較**P<0.01)

五、miR-3915抑制序列對(duì)A498細(xì)胞遷移能力的影響

Tranwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)24孔板Tranwell上室的A498細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組[(58.79±14.65)∶(170.90±16.64)，P<0.01]，表明miR-3915抑制序列具有抑制腎癌細(xì)胞A498遷移的作用。見(jiàn)圖7。

圖6 下調(diào)miR-3915表達(dá)后A498細(xì)胞中CMTM3和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)量

六、miR-3915抑制序列對(duì)A498細(xì)胞侵襲能力的影響

Tranwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)24孔板Tranwell上室的A498細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組[(44.10±8.34)∶(91.38±9.54)，P<0.01]，表明miR-3915抑制序列具有抑制腎癌細(xì)胞A498侵襲的作用。見(jiàn)圖8。

A:柱狀圖；B：實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A:柱狀圖；B：實(shí)驗(yàn)結(jié)果

討 論

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在細(xì)胞增殖、凋亡、衰老、分化及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[5]。miRNA主要通過(guò)結(jié)合靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)，形成沉默復(fù)合物，抑制靶基因mRNA的翻譯或者直接導(dǎo)致靶基因mRNA的降解，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控[6]。在腎癌中多種miRNA如miR-212、miR-200a、miR-30a-5p、miR-210-3p均存在表達(dá)異常，參與調(diào)控腎癌的增殖、遷移和侵襲，可作為腎癌增殖和轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)及早期診斷標(biāo)志物[7-10]。關(guān)于miR-3915的研究未見(jiàn)報(bào)道，特別是其在腎癌中的表達(dá)及作用機(jī)制尚不清楚。因此，探討miR-3915對(duì)腎癌遷移、侵襲的影響可能為抑制腎癌進(jìn)展提供新的分子靶標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，相較癌旁組織和正常腎小管上皮細(xì)胞株，miR-3915在腎癌組織和腎癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯增加，提示miR-3915在腎癌中可能是一種癌基因。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件MicroT-CDS和miRanda發(fā)現(xiàn)，miR-3915的靶基因可能是CMTM3。CMTM3基因是CMTM基因家族的一員，在胃癌、前列腺癌等多種腫瘤組織和細(xì)胞株中呈低表達(dá)[11-12]。CMTM3蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有顯著的抑制作用[13]。CMTM3蛋白在腎癌中表達(dá)降低，研究顯示其可發(fā)揮明顯的抑癌作用，提示CMTM3可能成為腎癌潛在的治療靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物[14]。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-3915和CMTM3-WT共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于miR-NC和CMTM3-WT共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，而miR-3915或miR-NC和CMTM3-MUT共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-3915可直接結(jié)合CMTM3。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指細(xì)胞的上皮表型在某些條件下轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型的生物學(xué)過(guò)程，是細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程涉及E-cadherin、β-catenin、Vimentin和Slug等蛋白表達(dá)的改變[15-16]。低表達(dá)miR-3915后，E-cadherin和β-catenin蛋白的表達(dá)增加，Vimentin和Slug蛋白的表達(dá)降低，表明腎癌A498細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程受到抑制，細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力降低。為了研究miR-3915在腎癌進(jìn)展中的作用，本研究在A498細(xì)胞中下調(diào)miR-3915的表達(dá)，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低表達(dá)miR-3915可抑制A498細(xì)胞的遷移和侵襲，提示miR-3915可能在腎癌的遷移和侵襲中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。

本研究結(jié)果表明，下調(diào)miR-3915的表達(dá)水平后，腎癌細(xì)胞A498的增殖和遷移能力均顯著降低。miR-3915可能通過(guò)下調(diào)CMTM3基因的表達(dá)，促進(jìn)腎癌細(xì)胞A498的增殖和遷移，為腎癌的防治研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。