劉圣雅，彭媛媛，張甫生，鄭炯*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(食品科學(xué)與工程國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶，400715)

大豆蛋白是目前唯一含有9種必需氨基酸且含量滿足人體需求的一種植物蛋白，常作為一種普遍廉價(jià)的蛋白資源[1]。大豆蛋白在食品中的應(yīng)用不僅依賴于其營養(yǎng)性，更依賴于其功能特性，如起泡性、乳化性、溶解性、凝膠性等。其中，凝膠性是大豆蛋白最重要的功能特性之一[2]。但是大豆蛋白凝膠的功能特性受加工條件的影響較大，如蛋白質(zhì)濃度、加工溫度、加工時(shí)間、pH值等[3]。

為提高大豆蛋白凝膠的穩(wěn)定性，一般采用添加大分子多糖的方法。研究表明，大豆蛋白與魔芋膠[4]、葡聚糖[5]的交聯(lián)作用有明顯的協(xié)同增稠效應(yīng)；大豆蛋白與殼聚糖和海藻酸鈉的復(fù)合體系較大豆蛋白而言，溶解性、乳化性和熱穩(wěn)定性均有明顯提高[6]。高酯果膠是來源豐富的天然水溶性多糖，主要成分是D-聚半乳糖醛酸[7]，其所帶的負(fù)電荷能夠與大豆蛋白表面的正電荷相結(jié)合，通過靜電作用力的驅(qū)動(dòng)形成可溶性聚合物[8]，高溫下可與大豆蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)[9]，形成大分子擁擠體系，使大豆蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)更加有序致密。適量的高酯果膠對(duì)大豆蛋白有一定的修飾作用，可以顯著改善大豆蛋白的凝膠強(qiáng)度，提高凝膠持水能力[10]。

酸性條件廣泛存在于食品加工和生產(chǎn)過程中，因此研究酸性條件對(duì)蛋白/多糖復(fù)合體系凝膠特性的影響具有重要意義。大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系的交聯(lián)作用主要由靜電相互作用力驅(qū)動(dòng)[11]，pH值會(huì)顯著影響其相互作用的過程。在復(fù)合體系的酸化過程中，酸化速率是決定其凝膠特性及微觀結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因素[12]，但目前對(duì)于大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系受酸性條件的影響還鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以大豆蛋白和高酯果膠為原料，通過添加不同濃度的葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)作為酸誘導(dǎo)劑，考察pH對(duì)復(fù)合體系流變特性、質(zhì)構(gòu)特性、Zeta電位和微觀結(jié)構(gòu)的影響，探討復(fù)合體系在特定pH條件下的凝膠特性，以期為大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系在酸性條件下的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆蛋白(食品級(jí)，蛋白質(zhì)含量為92%)，深圳一諾食品配料有限公司；高酯果膠(食品級(jí)，酯化度：65%)，廣州鴻易食品添加劑有限公司；葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL，食品級(jí))，鄭州食全食美商貿(mào)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004A電子分析天平，上海精天電子儀器有限公司；pHS-3C酸度計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；AR-G2旋轉(zhuǎn)流變儀，美國TA公司；CT3物性測(cè)定儀，美國Brookfield公司；Nano-ZS&MPT-2 Zeta電位及納米粒度儀，英國Malvern公司；JSM-6510LV鎢燈絲掃描電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社(JEOL)。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

參考張靜等[13]的方法，加以調(diào)整。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定大豆蛋白質(zhì)量濃度為50 g/L，高酯果膠質(zhì)量濃度為6 g/L，制備復(fù)合體系樣品，使其不過分黏稠，又保證了一定的蛋白質(zhì)濃度，在生產(chǎn)中具有實(shí)際意義。將大豆分離蛋白溶于pH=7.0的去離子水中，在25 ℃下攪拌20 min使之溶解完全，80 ℃ 下加熱使蛋白質(zhì)變性，待溶液澄清后，向大豆蛋白分散液中緩慢加入高酯果膠溶液，加熱攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)pH為7.0， 繼續(xù)加熱溶解30 min，得到均勻的混合液。將混合液靜置冷卻到室溫(20～40 ℃)后，用GDL溶液調(diào)節(jié)至特定pH，攪拌2 min后靜置加熱30 min，等待凝膠形成，將復(fù)合體系樣品在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 流變特性的測(cè)定

參考畢崇浩[14]的方法并稍作修改，用一次性滴管吸取適量樣品置于平板上，在表面涂一層硅油以防止樣品水分的蒸發(fā)，采用平板-平板測(cè)量系統(tǒng)，平板直徑40 mm，設(shè)置間隙1 mm。

動(dòng)態(tài)黏彈性測(cè)定:設(shè)定溫度25 ℃，掃描應(yīng)變1%，測(cè)量前樣品先靜置平衡5 min，應(yīng)力為0.5%，測(cè)定由低頻率(0.1 Hz)至高頻率(10 Hz)內(nèi)儲(chǔ)能模量(G′)、損耗模量(G″)及損耗角正切值(tanδ=G″/G′)隨角頻率的變化。

動(dòng)態(tài)時(shí)間掃描測(cè)定:設(shè)定溫度25 ℃，頻率為0.5 Hz， 掃描應(yīng)變1%，確保樣品在線性黏彈區(qū)內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定1 h內(nèi)樣品儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)的變化。

動(dòng)態(tài)溫度掃描測(cè)定:溫度以2 ℃/min的升溫速率從25 ℃升高至80 ℃，在80 ℃下保持15 min后，以5 ℃/min的速率從80 ℃下降至25 ℃，其中應(yīng)變?yōu)?%，頻率為1 Hz，記錄儲(chǔ)能模量(G′)、損耗模量(G″)隨時(shí)間和溫度的變化情況。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

采用CT3物性測(cè)定儀對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)地剖面分析(TPA)測(cè)定。設(shè)置以下參數(shù)：探頭P/0.5；測(cè)前速度1.00 mm/s； 測(cè)試速率1.00 mm/s；返回速度1.00 mm/s；觸發(fā)力20.0 g；壓縮形變程度20%。每組測(cè)試均做3次平行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為平均值。

1.3.4 Zeta電位的測(cè)定

吸取50 μL樣品溶液于25 mL容量瓶中，加入去離子水定容，將樣品溶液稀釋500倍后采用Malvern納米粒度儀測(cè)定不同pH下復(fù)合體系的Zeta電位。測(cè)定條件如下[15]：比色池規(guī)格為1 cm聚苯乙烯池，用一對(duì)0.45 cm2鉑電極，距為0.4 cm。測(cè)定溫度為25 ℃，平衡時(shí)間2 min。每組包含10到50次測(cè)量，依數(shù)據(jù)重現(xiàn)性而定，計(jì)算3次重復(fù)得到平均值為測(cè)定值。

1.3.5 微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

參考于翠柳[16]的方法加以調(diào)整，將樣品置于培養(yǎng)皿中，放入冰箱凍藏24 h，然后在-50 ℃下真空冷凍干燥72 h，取出后用手術(shù)刀在干燥好的凝膠中部取樣，切割成(5×5×10) mm的長條狀后進(jìn)行噴金處理，用掃描電子顯微鏡觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)，在15 kV的加速電壓和500倍的放大率下進(jìn)行觀察和拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，每次測(cè)試均需重新制備樣品。文中所有圖表均使用Origin 9.1和Microsoft Excel進(jìn)行繪制，利用SPSS 19.0對(duì)質(zhì)構(gòu)特性以及Zeta電位數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)，利用鄧肯式多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)復(fù)合體系流變特性的影響

2.1.1 動(dòng)態(tài)黏彈流變特性

圖1-A為復(fù)合體系儲(chǔ)能模量G′隨角頻率變化曲線圖，圖1-B為復(fù)合體系損耗模量G″隨角頻率變化曲線圖。

A-儲(chǔ)能模量;B-損耗模量圖1 復(fù)合體系儲(chǔ)能模量G′與損耗模量G″隨角頻率變化曲線Fig.1 Curves of dynamic modulus with angular frequency of composite system

由圖1可見，復(fù)合體系的G′和G″隨著pH的升高的而呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，在pH=5.0時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)復(fù)合體系內(nèi)部存在較強(qiáng)的靜電相互作用力，擁有最佳的凝膠強(qiáng)度[17]。當(dāng)pH繼續(xù)升高，G′和G″迅速降低，說明當(dāng)復(fù)合體系的pH偏離等電點(diǎn)時(shí)，由于正負(fù)電荷不平衡，靜電相互作用的減弱，導(dǎo)致大豆蛋白與高酯果膠交聯(lián)作用減弱，凝膠強(qiáng)度下降。整個(gè)過程中所有組別的G′均大于G″，且表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，即都隨角頻率的增加而增大，復(fù)合體系表現(xiàn)出一種顯著的膠體行為[18]。

圖2是tanδ隨角頻率變化曲線，復(fù)合體系的tanδ起初隨角頻率的增大而減小，隨后趨于穩(wěn)定，說明角頻率的增加導(dǎo)致體系的流動(dòng)性減弱，彈性增強(qiáng)，復(fù)合體系在高頻率的震動(dòng)作用下主要表現(xiàn)出彈性性質(zhì)。在pH=5.0時(shí)復(fù)合體系這一特征表現(xiàn)得最為明顯，說明樣品的固體彈性性質(zhì)最強(qiáng)，可賦予產(chǎn)品良好的口感。這與董蝶等[19]提出的，在pH接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)具有相同組成的混合物呈現(xiàn)更強(qiáng)的彈性特性這一結(jié)論相符。

圖2 損耗正切值隨角頻率變化曲線Fig.2 Curves of tanδ with angular frequency of composite system

2.2.2 動(dòng)態(tài)時(shí)間掃描

圖3為不同pH條件下復(fù)合體系的儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)隨時(shí)間變化的曲線。G′和G″都在pH=5.0時(shí)達(dá)到最大值，這與動(dòng)態(tài)黏彈性的測(cè)試結(jié)果相一致。隨著pH的降低，復(fù)合體系的流變特性發(fā)生明顯變化，當(dāng)pH為3.3時(shí)，復(fù)合體系內(nèi)正負(fù)電荷分配嚴(yán)重不均衡，靜電斥力增大，難以形成固體凝膠。在時(shí)間掃描測(cè)試中，體系的G′首先出現(xiàn)輕微的浮動(dòng)而后趨于穩(wěn)定，G″也具有同樣的趨勢(shì)。這可能是復(fù)合體系進(jìn)入測(cè)試后，由于最初所施加的剪切力破壞了體系原有的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生了短暫的波動(dòng)，隨著時(shí)間的增加，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)得到適應(yīng)和恢復(fù)，曲線趨于穩(wěn)定。在整個(gè)測(cè)試范圍內(nèi)，G′與G″都隨時(shí)間變化而呈現(xiàn)出微弱的上升趨勢(shì)，黏彈模量對(duì)頻率表現(xiàn)出較小的依賴性，這是凝膠的典型特征，說明凝膠內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本形成[20]。動(dòng)態(tài)模量曲線越平穩(wěn)，反映出的凝膠性質(zhì)越穩(wěn)定。在pH=5.0時(shí)復(fù)合體系的動(dòng)態(tài)模量曲線波動(dòng)性最小，受到破壞后恢復(fù)原狀的時(shí)間最快[21]，表明pH在5.0時(shí)為復(fù)合體系提供了最有利的環(huán)境因素。

A-儲(chǔ)能模量;B-損耗模量圖3 復(fù)合體系儲(chǔ)能模量G′與損耗模量G″隨時(shí)間變化曲線Fig.3 Curves of storage modulus and loss modulus of composite system with time

2.2.3 動(dòng)態(tài)溫度掃描

復(fù)合體系的儲(chǔ)能模量G′和耗能模量G″隨溫度變化的曲線如圖4所示。

A-儲(chǔ)能模量;B-損耗模量圖4 復(fù)合體系儲(chǔ)能模量G′與損耗模量G″隨溫度變化曲線Fig.4 Curves of storage modulus and loss modulus of composite system with temperature

復(fù)合體系的凝膠現(xiàn)象是大豆蛋白與高酯果膠的長鏈分子相互交聯(lián)從而將液體纏繞固定在內(nèi)的三維連續(xù)式網(wǎng)絡(luò)[22]。溫度升高會(huì)造成分子運(yùn)動(dòng)速率的加快，粒子間非共價(jià)力減弱[23-24]，交聯(lián)結(jié)構(gòu)受到破壞，難以形成相對(duì)穩(wěn)定的復(fù)合體系。pH=5.0時(shí)復(fù)合體系在整個(gè)溫度變化過程中始終保持著最大的動(dòng)態(tài)模量，高溫狀態(tài)下仍然表現(xiàn)出較穩(wěn)定的固體凝膠特性。這可能是由于此時(shí)體系內(nèi)部的靜電阻力和空間位阻較小，大豆蛋白分子表面帶靜電的疏水基團(tuán)被包埋進(jìn)分子內(nèi)部，為高酯果膠分子提供了足夠的結(jié)合位點(diǎn)，形成了穩(wěn)固的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠緩和高溫作用對(duì)凝膠特性造成的破壞[25]。當(dāng)pH遠(yuǎn)離大豆蛋白等電點(diǎn)時(shí)，體系內(nèi)的靜電相互作用失去平衡，分子間交聯(lián)位點(diǎn)減少，復(fù)合體系的動(dòng)態(tài)模量減小，表現(xiàn)為彈性性能降低，凝膠強(qiáng)度降低。

2.2 pH對(duì)復(fù)合體系質(zhì)構(gòu)特性的影響

表1為大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系的質(zhì)構(gòu)特性參數(shù)。凝膠的硬度主要取決于分子間交聯(lián)和纏繞的程度，復(fù)合體系的硬度隨pH的增大而增大，pH=5.0時(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他條件下的硬度，說明在此環(huán)境條件下凝膠內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)間存在最多的交聯(lián)位點(diǎn)。復(fù)合體系的內(nèi)聚性決定了其黏著性[26]，這2個(gè)指標(biāo)隨pH的變化表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，均在pH=5.0時(shí)表現(xiàn)出較高水平，而當(dāng)pH進(jìn)一步增大時(shí)，大豆蛋白與高酯果膠分子的靜電相互作用減小，引起復(fù)合體系內(nèi)聚力減弱，黏著性隨之下降。凝膠結(jié)構(gòu)的彈性與內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系，復(fù)合體系的彈性在pH=3.3時(shí)具有最小值，可能是由于pH低于等電點(diǎn)時(shí)導(dǎo)致的過度酸化，復(fù)合體系內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較疏松[27]。隨著pH的升高，復(fù)合體系的彈性逐漸增大并在pH=5.0時(shí)達(dá)到最大值，這一趨勢(shì)與流變特性的測(cè)定結(jié)果一致。咀嚼性是評(píng)價(jià)凝膠食品感官性質(zhì)的重要指標(biāo)，pH=5.0時(shí)復(fù)合體系的咀嚼性最大，對(duì)產(chǎn)品的口感具有有利影響，可以提高凝膠產(chǎn)品的品質(zhì)和風(fēng)味。

表1 復(fù)合體系的質(zhì)構(gòu)參數(shù)Table 1 Parameters of texture profile of composite system

注：在同一列中的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差)所帶的不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 pH對(duì)復(fù)合體系Zeta電位的影響

圖5為pH對(duì)復(fù)合體系Zeta電位的影響。由圖可知，隨著pH的增加，Zeta電位逐漸降低。在pH小于5.0時(shí)復(fù)合體系中的大豆蛋白分子和H+都帶有正電荷，此時(shí)靜電排斥力將成為主導(dǎo)[28]。當(dāng)復(fù)合體系pH降低，帶正電荷的H+濃度增加，導(dǎo)致靜電斥力和空間位阻增強(qiáng)，不足以使蛋白質(zhì)膠束穩(wěn)定存在。在pH=4.3時(shí)，復(fù)合體系的Zeta電位絕對(duì)值最小，是由于此時(shí)大豆蛋白所帶的正電荷與高酯果膠所帶的負(fù)電荷幾乎完全結(jié)合。當(dāng)pH繼續(xù)增大到5.0時(shí)，此時(shí)大豆蛋白接近高酯果膠“漂移”影響下的等電點(diǎn)[29]，大豆蛋白暴露在表面的極性基團(tuán)包埋進(jìn)分子內(nèi)部，大豆蛋白表面幾乎沒有電荷，Zeta電位主要由高酯果膠的帶電量決定，故Zeta電位表現(xiàn)為帶少量負(fù)電荷。此時(shí)的靜電相互作用會(huì)促進(jìn)大豆蛋白與高酯果膠聚集產(chǎn)生大量松散相連的聚集體簇，能形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的體系。當(dāng)pH繼續(xù)升高至等電點(diǎn)以上時(shí)，大豆蛋白帶負(fù)電荷，對(duì)于Zeta電位起到主要影響作用，隨著pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，Zeta電位減小。在整個(gè)變化過程中，復(fù)合體系的Zeta電位隨pH呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化趨勢(shì)，不同組別之間的Zeta電位存在顯著性差異(P<0.05)。

圖5 pH對(duì)復(fù)合體系Zeta電位的影響Fig.5 Effects of pH on Zeta potential of composite system

2.4 pH對(duì)復(fù)合體系微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖6分別為5種pH條件下復(fù)合體系凝膠的放大500倍的微觀結(jié)構(gòu)圖。圖6-A表明pH=3.3時(shí)復(fù)合體系的微觀結(jié)構(gòu)與其他組別存在顯著性差異。其片狀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)大面積坍塌，無法形成三維網(wǎng)絡(luò)，說明此時(shí)復(fù)合體系內(nèi)部的靜電相互作用極不平衡，根據(jù)Zeta電位的測(cè)量結(jié)果可知，此時(shí)體系帶有大量的正電荷，由于存在熱力學(xué)不相容，導(dǎo)致無法形成凝膠結(jié)構(gòu)[30]。隨著pH的升高(圖6-B、圖6-C)，GDL釋放出的H+吸附在大豆蛋白分子表面，降低了其表面的靜電排斥力，復(fù)合體系勾連成網(wǎng)狀，出現(xiàn)了部分條狀、網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)，但分子內(nèi)部存在空洞和破損，表面粗糙，某些部位存在顆粒狀的結(jié)構(gòu)，此時(shí)的空間結(jié)構(gòu)仍然復(fù)雜無序，是復(fù)合體系凝膠特性較差的原因。

圖6-D為pH=5.0時(shí)，此時(shí)復(fù)合體系內(nèi)部進(jìn)一步發(fā)生變化，由于存在良好的靜電相互作用力，結(jié)構(gòu)表面光滑，孔徑小且致密均勻，三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，形成連續(xù)性更佳的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。魏東旭等[31]研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白的疏水性隨著pH的升高而減小，在pH=5.0附近時(shí)，大豆蛋白疏水性達(dá)到最小值，之后又繼續(xù)上升。大豆蛋白疏水性減小是由于原先暴露的側(cè)鏈被包埋進(jìn)蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部，高酯果膠可以與大豆蛋白在分子內(nèi)部形成更多的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，三維網(wǎng)絡(luò)由疏松變得緊湊穩(wěn)定。因此，此時(shí)的微觀結(jié)構(gòu)內(nèi)部孔徑表現(xiàn)得最為致密有序。當(dāng)pH進(jìn)一步增大時(shí)，復(fù)合體系內(nèi)的氫離子難以維持靜電平衡，大豆蛋白分子側(cè)鏈暴露，分子內(nèi)部的結(jié)合位點(diǎn)減少，復(fù)合體系的交聯(lián)結(jié)構(gòu)部分?jǐn)嗔?，排列較為無序，孔徑也再次變得不均勻。

圖6 不同pH條件下復(fù)合體系的掃描電鏡圖Fig.6 SEM of composite system with different pH

3 結(jié)論

在pH為3.3～5.6內(nèi)，酸性條件對(duì)大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系的凝膠特性有較大影響。當(dāng)pH=5.0時(shí)，等電點(diǎn)附近的大豆蛋白分子存在較多的交聯(lián)位點(diǎn)，復(fù)合體系在靜電相互作用下形成均勻致密的微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，宏觀上表現(xiàn)出最穩(wěn)定的彈性固體特性。當(dāng)pH繼續(xù)降低，復(fù)合體系的流變特性和質(zhì)構(gòu)特性惡化，在pH=3.3時(shí)，過度酸化導(dǎo)致復(fù)合體系難以形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠特性遭到破壞。復(fù)合體系Zeta電位的測(cè)定，揭示了凝膠結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。研究結(jié)果可為提高大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系的穩(wěn)定性和改善產(chǎn)品口感提供理論依據(jù)，拓寬其應(yīng)用范圍。