吳 昊，焦志勇，郝 寧，許 晟

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800； 2.江蘇先進(jìn)生物與化學(xué)制造協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210009)

L-鳥(niǎo)氨酸又名α,δ-二氨基戊酸，分子式為C5H12N2O2，它是重要的堿性氨基酸，主要參與鳥(niǎo)氨酸循環(huán)(尿素循環(huán))，用于生物體內(nèi)瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸及多胺的生物合成，對(duì)于體內(nèi)氨態(tài)氮的排出有重要作用[1]。L-鳥(niǎo)氨酸及其衍生物具有保肝護(hù)肝、健腦、解毒、抑制癌細(xì)胞、促進(jìn)生長(zhǎng)和減肥等多重醫(yī)學(xué)與保健作用[2]，L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)品在醫(yī)藥、保健領(lǐng)域中的應(yīng)用日益廣泛。目前微生物發(fā)酵直接制備L-鳥(niǎo)氨酸已經(jīng)逐漸成為L(zhǎng)-鳥(niǎo)氨酸的主要生產(chǎn)方法[3-4]，但是與傳統(tǒng)的酶水解精氨酸法相比，L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液中含有大量的色素，高效脫除其中的色素對(duì)保證產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要。

目前，L-鳥(niǎo)氨酸的提取過(guò)程中往往將超濾處理后的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)離子交換吸附其中的L-鳥(niǎo)氨酸，通過(guò)氨水解吸獲得含有L-鳥(niǎo)氨酸的洗脫液，將其濃縮后進(jìn)行酸化結(jié)晶，再對(duì)粗晶體溶解后加入粉末活性炭進(jìn)行脫色，脫色液再次結(jié)晶獲得色澤合格的產(chǎn)品[5-6]。在此過(guò)程中，由于離子交換樹(shù)脂對(duì)色素具有明顯的吸附作用，影響了樹(shù)脂的分離效率，同時(shí)氨水解吸會(huì)將吸附的色素與L-鳥(niǎo)氨酸幾乎同時(shí)洗脫，增加了后期的純化壓力和分離損失[7]。盡管有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)納濾膜分離可將L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液中的大部分色素?cái)r截[8]，但膜污染也比較嚴(yán)重，導(dǎo)致通量迅速衰減，同時(shí)納濾膜對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸也具有一定的攔截?fù)p失。

針對(duì)以上問(wèn)題，本文中，筆者以顆?；钚蕴繛槊撋珓?，開(kāi)展L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液的脫色研究，考察多種因素對(duì)脫色效果的影響，在此基礎(chǔ)上建立活性炭動(dòng)態(tài)脫色與再生工藝。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

DSHZ-300A型臺(tái)式水浴恒溫振蕩器，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；BT01-100M型蠕動(dòng)泵，保定蘭格恒流泵有限公司；pHS-3C型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；Ultimate 3000型高效液相色譜儀，美國(guó)Dionex公司；紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；玻璃層析柱，晚晴化玻儀器有限公司。

1.2 原料與試劑

采用精氨酸缺陷型谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum1006(CGMCC No.3663)制備L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)離心和超濾處理后為棕黃色透明液體，pH=6.7，其中含L-鳥(niǎo)氨酸34 g/L、L-谷氨酸0.22 g/L、L-丙氨酸0.67 g/L、L-甘氨酸0.79 g/L、葡萄糖0.5 g/L，南京工業(yè)大學(xué)郝寧課題組提供。

大孔非極性吸附樹(shù)脂(HZ-802、HZ830)、大孔弱極性吸附樹(shù)脂(HZ-818)、大孔中等極性吸附樹(shù)脂(HZ-806)，上海華震科技有限公司；大孔弱極性吸附樹(shù)脂AB-8，南開(kāi)大學(xué)化工廠。

顆粒活性炭JL、GH、ZS、ZX-N分別由蘇州佳聯(lián)、唐山光華晶科、溧陽(yáng)竹溪等活性炭生產(chǎn)企業(yè)提供(均篩選至0.38～0.54 mm)；H2SO4、NaOH、NaNO3均為分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；L-鳥(niǎo)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma試劑公司。檢測(cè)中所使用的其他試劑均為色譜純或分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樹(shù)脂吸附色素性能考察

將大孔吸附樹(shù)脂用2倍體積的無(wú)水乙醇浸泡2 h，使其充分溶脹。過(guò)濾后，再用3～4倍體積的去離子水浸泡樹(shù)脂，并不時(shí)攪動(dòng)，通過(guò)多次過(guò)濾，將乙醇完全置換出即可使用。將經(jīng)過(guò)超濾處理的L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液調(diào)節(jié)至pH 5.0，分別取30 mL，加入3 g吸附樹(shù)脂，置于恒溫水浴振蕩器中，以150 r/min振蕩吸附4 h。過(guò)濾后，根據(jù)樣品檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算出大孔吸附樹(shù)脂對(duì)色素的脫除率及L-鳥(niǎo)氨酸的脫色損失。

1.3.2 活性炭靜態(tài)脫色試驗(yàn)

取經(jīng)過(guò)超濾處理的L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液100 mL，調(diào)節(jié)至設(shè)定的pH，加入一定量的活性炭(0.38～0.54 mm)，在一定溫度下，置于恒溫水浴振蕩器中，以150 r/min振蕩脫色一定時(shí)間，使其對(duì)色素的吸附達(dá)到平衡。過(guò)濾后根據(jù)樣品檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算出活性炭對(duì)色素的吸附容量、脫色率及L-鳥(niǎo)氨酸的脫色損失。

1.3.3 活性炭動(dòng)態(tài)脫色試驗(yàn)

在玻璃層析柱中填裝16.5 g顆粒活性炭(0.38～0.54 mm)，活性炭床層直徑為1.52 cm，床層高度為27.5 cm，高徑比為18，床層填充體積為50 mL，將其設(shè)定為1倍床層體積(1.0 BV)，作為考察動(dòng)態(tài)脫色流出曲線的體積計(jì)量單位。將L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液預(yù)熱到70 ℃，按照一定的流速經(jīng)蠕動(dòng)泵通入活性炭層析柱，并自上而下流出層析柱，每間隔一定體積，對(duì)流出的脫色液進(jìn)行取樣分析，繪制出流出曲線。

1.3.4 檢測(cè)方法

L-鳥(niǎo)氨酸的定量檢測(cè)采用異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化法，用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。

料液中的色素含量采用分光光度法檢測(cè)，以純水作參比，黃色素在430 nm波長(zhǎng)下有較好的吸收峰，故以超濾處理后的發(fā)酵液濃縮至1/3體積時(shí)的吸光值A(chǔ)430作為基準(zhǔn)，設(shè)定該基準(zhǔn)液的色素含量為ca=1.0 U/mL，在不同稀釋倍數(shù)下，根據(jù)分光光度計(jì)的吸光值表征色素含量的高低，建立色素含量的函數(shù)關(guān)系，對(duì)發(fā)酵液中色素的含量進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定[10]。根據(jù)繪制的色素標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合得到回歸方程為c=0.894 17A+0.003 24，R2=0.999 88，線性關(guān)系顯著，可用于表征色素含量。

料液的透光率T430，在430 nm下采用分光光度計(jì)檢測(cè)，以純水為參比，標(biāo)定為T(mén)430=100%。

活性炭比表面積及孔容孔徑的測(cè)試，采用BET方程計(jì)算比表面積，t值法計(jì)算外表面積和孔容積，密度函數(shù)理論(DFT)計(jì)算樣品的孔徑分布。

活性炭零電荷點(diǎn)pHPZC(水溶液中固體表面凈電荷為零時(shí)的pH)的檢測(cè)采用質(zhì)量滴定法[11]。首先將2 g經(jīng)過(guò)去離子水洗至中性并干燥的活性炭加入50 mL的0.05 mol/L NaNO3溶液中(pH為7.0)，用N2吹掃脫除其中的CO2，將瓶口密封后在25 ℃下振蕩48 h后測(cè)定其pH作為pHPZC0，隨后將多份50 mL的0.05 mol/L NaNO3溶液均調(diào)節(jié)至該pH，并分別加入0.05、0.25、0.5、1.0、2.5和5.0 g活性炭，按以上方法振蕩48 h后檢測(cè)pH，直至pH不變?yōu)橹梗瑢⒃損H作為pHPZC。

1.4 活性炭脫色性能與再生效果的計(jì)算

吸附容量的計(jì)算見(jiàn)式(1)。

Qi=(ci0V0-ci1V1)/m

(1)

式中：Qi為吸附劑對(duì)組分i的吸附容量，ci0、ci1為發(fā)酵液和脫色液中組分i的濃度，V0、V1為發(fā)酵液和脫色液的體積，m為活性炭的質(zhì)量。

脫色率(損失率)的計(jì)算見(jiàn)式(2)。

脫色率(損失率)=(ci0V0-ci1V1)/(ci0V0)×100%

(2)

活性炭再生率的計(jì)算見(jiàn)式(3)。

活性炭再生率=Q1/Q0×100%

(3)

式中：Q1為再生后的活性炭對(duì)色素吸附容量，Q0為新活性炭對(duì)色素的吸附容量。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附樹(shù)脂對(duì)色素的吸附選擇性及色素性質(zhì)的確定

取預(yù)處理好的樹(shù)脂各3.0 g，分別加入30 mL發(fā)酵液，在20 ℃、150 r/min的條件下振蕩吸附4 h，考察其對(duì)色素的脫除效果，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同樹(shù)脂對(duì)色素的吸附性能比較Fig.1 Decoloration performance of different resins

由圖1可見(jiàn)，非極性和弱極性吸附樹(shù)脂對(duì)色素的吸附能力均強(qiáng)于中等極性吸附樹(shù)脂HZ-806，這些現(xiàn)象說(shuō)明L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液中的大部分色素可能屬于非極性或弱極性分子[12]。由于大孔吸附樹(shù)脂在吸附色素時(shí)，L-鳥(niǎo)氨酸的脫色損失較大，因此不適合用吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫色處理。

2.2 脫色用顆?；钚蕴康倪x擇

向L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液中分別加入數(shù)種顆?；钚蕴窟M(jìn)行脫色性能的比較，脫色條件為 pH 6.5，活性炭添加量為5 g/L，在60 ℃、150 r/min條件下振蕩脫色40 min，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 活性炭脫色性能的比較Fig.2 Decolorization performance of different activated carbons

由圖2可見(jiàn)，在pH 6.5下，顆?；钚蕴縅L與GH的脫色率明顯高于其他顆?；钚蕴炕钚蕴俊?/p>

為了分析相關(guān)顆?；钚蕴棵撋阅懿町惖脑?，對(duì)各種顆?；钚蕴康奈锢斫Y(jié)構(gòu)與零電荷點(diǎn)pHPZC進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知：前3種顆?；钚蕴康谋缺砻娣e均明顯高于脫色性能最弱的顆?；钚蕴縕X-N，說(shuō)明較大的比表面積有利于活性炭吸附色素，但比表面積最大的GH所具有的脫色性能不如JL，可見(jiàn)比表面積并非衡量活性炭脫色潛力的唯一因素?；钚蕴康拿撋阅茈S著平均孔徑和活性炭的比孔容的增加而提高。這可能是由于色素分子的吸附存在尺寸排斥效應(yīng)，活性炭對(duì)色素的吸附選擇性會(huì)受到孔徑-孔容分布狀況的影響[13]。當(dāng)活性炭孔徑與被吸附質(zhì)分子直徑的比值為1.7～3時(shí)最有利于吸附[14]，大多數(shù)水溶性有機(jī)物的直徑為1～3 nm[15]，因此平均孔徑為3.447 nm的JL活性炭吸附色素能力更強(qiáng)，但其脫色損失也最高。由于顆?；钚蕴縂H的脫色損失率僅為0.78%，故選擇此活性炭進(jìn)行后續(xù)脫色研究。

表1 活性炭的物理結(jié)構(gòu)與零電荷點(diǎn)

2.3 pH對(duì)活性炭脫色性能的影響

為了避免酸性料液對(duì)管線設(shè)備的腐蝕，著重考察活性炭在較高pH下的脫色性能。分別將L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液調(diào)節(jié)至pH 6.0～7.0進(jìn)行脫色，活性炭添加量為5 g/L，在60 ℃、150 r/min條件下，振蕩脫色40 min，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 pH對(duì)活性炭脫色性能的影響Fig.3 Effects of pH on decolorization of activated carbon

由圖3可知：pH為6.0～6.8時(shí)，活性炭脫色損失較小，但當(dāng)pH增至7.0時(shí)，L-鳥(niǎo)氨酸回收率明顯下降。顆?；钚蕴縂H的零電荷點(diǎn)pHPZC為6.83(表1)，而L-鳥(niǎo)氨酸的等電點(diǎn)pI約為9.73，根據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道，在pH 6～6.5的范圍內(nèi)，絕大部分L-鳥(niǎo)氨酸分子攜帶一個(gè)正電荷，此時(shí)活性炭表面攜帶正電荷，與其存在一定的靜電排斥，所以脫色損失小，這也是其他零電荷點(diǎn)pHPZC<6.5的顆?；钚蕴吭诖藀H下脫色損失大的原因(圖2、表1)。繼續(xù)增大pH，活性炭GH表面開(kāi)始攜帶負(fù)電荷，而絕大部分L-鳥(niǎo)氨酸分子依然攜帶正電荷，導(dǎo)致脫色損失加大。pH對(duì)脫色效果的影響較為顯著，較低的pH有利于脫色，但當(dāng)pH>6.8時(shí)，脫色率顯著降低，這與前人提出的pH

2.4 溫度和時(shí)間對(duì)活性炭脫色性能的影響

將L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)為6.5，考察溫度對(duì)活性炭脫色性能的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 溫度對(duì)活性炭脫色性能的影響

由表2可知：較高的脫色溫度有利于減少L-鳥(niǎo)氨酸的脫色損失，同時(shí)脫色率隨著溫度的升高而逐漸增大，但當(dāng)溫度上升到80 ℃后，脫色率不升反降，說(shuō)明發(fā)生了色素解吸。

以此確定脫色溫度為70 ℃。在此溫度下考察脫色時(shí)間對(duì)脫色性能的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 脫色時(shí)間對(duì)活性炭脫色性能的影響Fig.4 Effects of time on decolorization of activated carbon

由圖4可知：在脫色的前30 min，活性炭對(duì)色素的吸附迅速提高，至40 min時(shí)脫色率已達(dá)到77%，并維持了一段時(shí)間，說(shuō)明色素吸附達(dá)到平衡；而脫色時(shí)間達(dá)到60 min后，脫色率略有下降，說(shuō)明在長(zhǎng)期高溫環(huán)境中活性炭發(fā)生了色素解吸行為。同時(shí)，當(dāng)色素吸附達(dá)到平衡，L-鳥(niǎo)氨酸的脫色回收率出現(xiàn)下降，說(shuō)明顆?；钚蕴?jī)?yōu)先吸附色素，之后才開(kāi)始吸附L-鳥(niǎo)氨酸。由此可見(jiàn)，脫色時(shí)間40 min即可，不宜過(guò)長(zhǎng)。

2.5 活性炭用量對(duì)脫色性能的影響

將L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)為6.5，70 ℃脫色40 min，活性炭用量分別為5.0～15.0 g/L，考察活性炭用量對(duì)脫色性能的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 活性炭用量對(duì)脫色性能的影響Fig.5 Effects of activated carbon dosage on the decolorization

由圖5可知：隨著活性炭用量的增加，脫色率提高，當(dāng)活性炭用量為15.0 g/L時(shí)，脫色率已達(dá)95%以上，但單位質(zhì)量活性炭對(duì)色素的吸附容量Q僅為14.68 U/g，比活性炭用量為5.0 g/L時(shí)下降59%?？梢?jiàn)提高活性炭的利用效率需采用動(dòng)態(tài)脫色技術(shù)。

2.6 進(jìn)料流速對(duì)活性炭動(dòng)態(tài)脫色性能的影響

L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液被調(diào)節(jié)至pH 6.5并預(yù)熱至70 ℃，2.5 L發(fā)酵液(50 BV)分別以3.0～9.0 BV/h的進(jìn)料流速上柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)脫色處理，當(dāng)流出的脫色液中的色素濃度為發(fā)酵液中含量的5%時(shí)，即可認(rèn)為發(fā)生穿透，其流出曲線見(jiàn)圖6。

圖6 不同進(jìn)料流速下的色素流出曲線Fig.6 Effluent curves of pigment at various flow rates

由圖6可知：當(dāng)進(jìn)料流速?gòu)? BV/h提高至7 BV/h，發(fā)生色素穿透的位置逐漸推后，說(shuō)明活性炭的脫色效果顯著改善，推測(cè)在此范圍內(nèi)液膜擴(kuò)散為控速步驟，增加進(jìn)料流速有利于減少活性炭表面液膜層的厚度，使色素被快速吸附。但當(dāng)進(jìn)料流速進(jìn)一步提高至9 BV/h，色素穿透位置提前，表明脫色效果下降，這可能是由于此時(shí)發(fā)酵液在層析柱內(nèi)停留時(shí)間過(guò)短，導(dǎo)致活性炭導(dǎo)致色素未能與活性炭發(fā)生充分的吸附作用。其中，進(jìn)料流速為7 BV/h時(shí)的脫色率最高，連續(xù)處理45 BV發(fā)酵液才出現(xiàn)穿透，此時(shí)活性炭對(duì)色素吸附容量Q達(dá)到50.5 U/g，總脫色率達(dá)到98.71%，脫色液的透光率T430達(dá)99%，呈無(wú)色透明狀。

考察相關(guān)進(jìn)料流速下的L-鳥(niǎo)氨酸流出曲線，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 不同進(jìn)料流速下的L-鳥(niǎo)氨酸流出曲線Fig.7 Effluent curves of L-ornithine at various flow rates

由圖7可知：在動(dòng)態(tài)脫色過(guò)程中活性炭對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸的吸附極少，在3～9 BV/h的進(jìn)料流速下，當(dāng)流出體積為1.0 BV時(shí)均出現(xiàn)L-鳥(niǎo)氨酸完全穿透現(xiàn)象，產(chǎn)品脫色損失均在3%以?xún)?nèi)，故選擇活性炭層析柱動(dòng)態(tài)脫色的進(jìn)料流速為7 BV/h。

2.7 活性炭層析柱的解吸與再生

通過(guò)顆粒活性炭再生預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熱水可將活性炭吸附的少量L-鳥(niǎo)氨酸解吸，但幾乎不能解吸色素，活性炭再生率只有8.5%，而1.0 mol/L的稀H2SO4對(duì)活性炭的再生率為74%，1.0 mol/L的NaOH溶液對(duì)活性炭的再生率為87%，因此確定采用熱水與NaOH兩步解吸法：第一步采用80 ℃熱水解吸活性炭層析柱中殘留的L-鳥(niǎo)氨酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)80 ℃熱水可解吸回收丁二酸，在3.0 BV/h的解吸流速下，2.0 BV的熱水可回收70%被活性炭吸附的L-鳥(niǎo)氨酸，使L-鳥(niǎo)氨酸的脫色率達(dá)到99%。第二步采用1.0 mol/L NaOH作為再生劑解吸色素，解吸溫度為80 ℃，再生劑用量為5.0 BV，最后用去離子水將殘留的堿液洗出，使流出液的pH降至7.5以下，3種解吸流速下的色素流出曲線見(jiàn)圖8。

圖8 不同解吸流速下的色素流出曲線Fig.8 Desorption curves of pigment at different elution rate

由圖8可知：NaOH的解吸流速為5.0 BV/h時(shí)，3.0 BV的再生劑就可以解吸出絕大部分色素。以未使用過(guò)的活性炭作為對(duì)照，考察相關(guān)活性炭的再生效果，結(jié)果顯示再生率均在93%以上，其中5.0 BV/h解吸速度下獲得再生活性炭，活性炭再生率達(dá)到96.5%。

考察活性炭進(jìn)行反復(fù)脫色及再生性能，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 再生次數(shù)對(duì)活性炭脫色性能的影響

由表3可知：活性炭層析柱再生后重復(fù)使用4次，其對(duì)同一批發(fā)酵液的脫色率均穩(wěn)定在97%以上，脫色液的透光率T430均達(dá)98.5%以上，接近純水的透光率，呈無(wú)色透明狀。L-鳥(niǎo)氨酸的損失率均在1%以?xún)?nèi)，活性炭再生效果穩(wěn)定。

3 結(jié)論

1)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液中的大部分色素可能屬于非極性或弱極性分子，具有較高的零電荷點(diǎn)pHPZC、較大的平均孔徑和比孔容積的活性炭GH在pH 6.5下對(duì)色素具有較好的吸附能力，而過(guò)高的脫色溫度和過(guò)長(zhǎng)的脫色時(shí)間不利于活性炭對(duì)色素的吸附。

2)確定了活性炭層析柱對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液的動(dòng)態(tài)脫色/再生工藝：進(jìn)料流速為7.0 BV/h、脫色溫度70 ℃，可連續(xù)處理45 BV的發(fā)酵液。采用兩步解吸法再生活性炭，第一步采用80 ℃熱水在3.0 BV/h的流速下解吸殘留的L-鳥(niǎo)氨酸，處理量為2.0 BV；第二步在同樣的溫度下采用以1.0 mol/L NaOH以5.0 BV/h流速解吸色素，處理量為5.0 BV。在該條件下，脫色率保持在97%以上，而L-鳥(niǎo)氨酸的損失率低于1%，活性炭重復(fù)使用性能穩(wěn)定。