潘威威,王照莉,王苗苗,童妃妃,張強(qiáng)

(安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

羊肚菌(Morchellaesculenta)是一種原產(chǎn)于中國(guó)的食、藥用真菌，也是公認(rèn)的健康食品和藥物開(kāi)發(fā)無(wú)可比擬的資源[1]。羊肚菌中含有蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、膳食纖維和碳水化合物等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌和增強(qiáng)人體免疫力等多種藥用特性[2，3]。羊肚菌中的蛋白質(zhì)含量高達(dá)32.7%，富含8種人體所必需的氨基酸，是營(yíng)養(yǎng)食品和功能性食品開(kāi)發(fā)的極好材料，但尚未廣泛被人類利用[4，5]。

近年來(lái)，蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾已成為保健品和功能性食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。借助共價(jià)修飾，在蛋白質(zhì)分子表面結(jié)合一些化合物可以使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能發(fā)生顯著的變化[6]。已有研究表明，利用糖類或酚類對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)修飾，可顯著提高原蛋白的抗氧化活性[7，8]?？箟难嵊置S生素C(VC)，是一種以抗氧化功能為特色的人體必需的水溶性維生素。VC具有抗腫瘤活性，能夠增強(qiáng)人體免疫力，預(yù)防心腦血管疾病，還能夠通過(guò)清除自由基而起到延遲人體衰老的作用[9，10]。而且，VC分子中含有羰基，能夠借助美拉德反應(yīng)與蛋白質(zhì)分子表面的氨基發(fā)生共價(jià)結(jié)合。用VC對(duì)羊肚菌蛋白(MPI)進(jìn)行抗壞血酸化修飾有望賦予產(chǎn)物VC和原羊肚菌蛋白的雙重營(yíng)養(yǎng)和功能特性，但是，至今以VC修飾MPI的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以總抗氧化活性為考察指標(biāo)，探討不同因素對(duì)MPI抗壞血酸化修飾的影響，并用響應(yīng)面法優(yōu)化MPI抗壞血酸化修飾的最佳工藝條件，以為將其作為保健品和功能性食品的開(kāi)發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

羊肚菌菌種(ACCC 50537 )購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；L-抗壞血酸、鉬酸銨、磷酸鈉和硫酸均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑總公司。

主要儀器中756MC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和PHSJ-4A型精密pH計(jì)均購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50型真空冷凍干燥機(jī)購(gòu)自北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；H-18R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自北京安必升科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1MPI的提取

參照文獻(xiàn)[11]采用液態(tài)發(fā)酵的方法獲得羊肚菌菌絲體。然后，將菌絲體凍干，粉碎，按文獻(xiàn)[12]的方法提取羊肚菌蛋白(MPI)。

1.2.2MPI的抗壞血酸化修飾

將0. 10g MPI溶于10mL 蒸餾水，按設(shè)定的比例加入VC，調(diào)整pH為所需，密封，沸水浴加熱一定時(shí)間，冰浴冷卻，用3500Da (3500u)的透析袋透析48h，凍干，得到抗壞血酸化修飾的羊肚菌蛋白(VC-MPI)。

1)單因素試驗(yàn) 選取pH(9.0、10.0、11.0、12.0、13.0)、抗壞血酸與MPI的質(zhì)量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)及反應(yīng)時(shí)間(30、60、90、120、150min)3 個(gè)因素，分別設(shè)置不同的水平，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定各因素對(duì)羊肚菌蛋白抗壞血酸化修飾的影響。

2)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以pH、抗壞血酸與羊肚菌蛋白的質(zhì)量比及反應(yīng)時(shí)間為考察因素，以總抗氧化活性為響應(yīng)值，使用軟件Design Expert 8.06的 Box-Behnken 設(shè)計(jì)模式進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化MPI的抗壞血酸化化修飾工藝。

1.2.3總抗氧化活性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]的方法配制鉬酸銨反應(yīng)體系。每3mL的鉬酸銨反應(yīng)體系中加入0.3mL樣品，混合均勻，于95℃恒溫水浴鍋中孵育90min，室溫冷卻后，在695nm處測(cè)定光密度D695nm值，樣品液的光密度值越大，其總抗氧化能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1pH對(duì)抗壞血酸化修飾的影響

pH對(duì)VC-MPI總抗氧化活性的影響結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨pH的升高，VC-MPI的總抗氧化活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，pH為12.0時(shí)，VC-MPI的總抗氧化活性最強(qiáng)。

2.1.2VC與MPI質(zhì)量比對(duì)抗壞血酸化修飾的影響

VC與MPI質(zhì)量比對(duì)VC-MPI總抗氧化活性影響的結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2結(jié)果表明：隨著反應(yīng)中VC加入量的增加，總抗氧化活性逐漸升高，當(dāng)VC與MPI質(zhì)量比為4∶1時(shí)達(dá)到最大值，之后再提高VC的用量，總抗氧化活性略有下降。這是由于在一定范圍內(nèi)增加反應(yīng)體系中VC的用量，可推動(dòng)反應(yīng)向正方向進(jìn)行，因而產(chǎn)物的總抗氧化活性提高。但當(dāng)所有的MPI為VC所飽和時(shí)，再提高VC的用量，產(chǎn)物的總抗氧化能力不會(huì)再提高。

圖1 不同pH下的總抗氧化活性 圖2 不同VC與MPI質(zhì)量比下的總抗氧化活性

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間下的總抗氧化活性

2.1.3反應(yīng)時(shí)間對(duì)抗壞血酸化修飾的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)VC-MPI的總抗氧化活性影響的結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3結(jié)果表明：隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，總抗氧化活性逐漸升高，120min時(shí)達(dá)到最大值，之后開(kāi)始下降，這可能是過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間導(dǎo)致了產(chǎn)物的降解。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1模型預(yù)測(cè)與統(tǒng)計(jì)分析

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

注: 括號(hào)中數(shù)據(jù)為真實(shí)值。

響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)及對(duì)應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。借助 Design Expert 8.06軟件對(duì)表1 中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得總抗氧化活性對(duì)自變量pH(X1)、VC與MPI質(zhì)量比(X2)及反應(yīng)時(shí)間(X3)的二次多項(xiàng)回歸方程:

由表2方差分析的結(jié)果可知，模型的F值為 324.62，P<0.0001，表示模型極顯著，失擬項(xiàng)F值是1.03，P= 0.4680 > 0.05，表示失擬不顯著。模型總決定系數(shù)為0.998，校正決定系數(shù)為0.995，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)實(shí)際值與預(yù)測(cè)值具有很高的相關(guān)性，信噪比(49.12)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于4，變異系數(shù)(1.14%)較小，表明模型方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合良好，可信度較高，能夠準(zhǔn)確地反映響應(yīng)值(總抗氧化能力)隨各因素的變化規(guī)律。由表2中的F值可知，3個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度大小依次為pH(X1)>反應(yīng)時(shí)間(X3)>VC與MPI的質(zhì)量比(X2)。模型二次項(xiàng)(X12、X22、X32)、一次項(xiàng)中的X1、X3及交互相X1X2、X1X3和X2X3均達(dá)到顯著水平(P<0.01)，該結(jié)果說(shuō)明總抗氧化能力受各個(gè)因素的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表2 響應(yīng)面模型的方差分析

注: **表示極顯著水平(P<0.01)?？倹Q定系數(shù)R2=0.998，校正決定系數(shù)R2=0.995，信噪比49.12，變異系數(shù)1.14%。

2.2.2響應(yīng)曲面圖分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸模型繪出了3 個(gè)因素交互作用的響應(yīng)曲面圖和等值線圖(圖4)。從圖4可知：各曲面圖上均存在最高點(diǎn)，說(shuō)明響應(yīng)面的設(shè)計(jì)較為合理。

圖4 響應(yīng)面分析圖

由圖4中各曲面的斜度及等值線的形狀可以看出，pH和VC與MPI質(zhì)量比的交互作用最大，對(duì)抗壞血酸化反應(yīng)的影響最大，表現(xiàn)為曲線較陡，等值線呈明顯的橢圓狀；反應(yīng)時(shí)間與pH的交互作用次之，對(duì)抗壞血酸化反應(yīng)有一定程度的影響；而VC與MPI質(zhì)量比與反應(yīng)時(shí)間的交互作用最小，對(duì)抗壞血酸化反應(yīng)的影響也較小，這與表2中的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果相一致。在模型范圍內(nèi)，令響應(yīng)值最大化，通過(guò)Design-Expert軟件得到MPI壞血酸化修飾的的最佳條件如下：pH 12.22，VC與MPI質(zhì)量比4.01∶1，反應(yīng)時(shí)間127.26min，總抗氧化活性可達(dá)0.891?？紤]到實(shí)際操作的方便性，修正上述工藝條件為：pH 12.20，抗壞血酸與羊肚菌蛋白質(zhì)量比4.0∶1，反應(yīng)時(shí)間130min，在該條件下進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)物的總抗氧化活性為0.876，與理論值基本吻合，表明該模型可以較好地預(yù)測(cè)MPI的抗壞血酸化修飾情況。

3 結(jié)論

MPI抗壞血酸化修飾的最佳工藝條件為：pH 12.20，VC與MPI質(zhì)量比4 ∶1，反應(yīng)時(shí)間130min。本研究獲得了一種行之有效的MPI的抗壞血酸化修飾方法，為MPI在功能性食品和營(yíng)養(yǎng)保健品方面的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。