幸晶晶

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

江濤

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

磺化瀝青是一種以瀝青為原料，經(jīng)磺化處理后得到的改性高分子化合物，是一種既可以部分溶于水又溶于油的棕黑色物質(zhì)，能夠分散在泥漿中起到良好的護壁和防塌效果[1，2]，具有良好的堵漏、防塌、潤滑、減阻、控溫等性能，曾作為水基鉆井液，應用廣泛。其主要成分為瀝青磺酸鹽、少量的瀝青酚鹽、無機物、氧化瀝青、飽和烴及單、雙環(huán)、多環(huán)芳烴等[3]，具有高色度、高化學需氧量(COD)、可生化性差等特點，屬于難降解有機物[4]。針對于包含磺化瀝青的鉆井液的污染物降解，目前處理方法主要有化學法、物化法、生物法組合和工藝處理法4大類[5～10]，并都取得了較好的降解效果，但工藝較復雜、成本高，且容易產(chǎn)生二次污染。隨著微生物處理技術的深化研究和工程實踐經(jīng)驗的積累，微生物處理技術在有毒、有害的有機工業(yè)廢水中的治理中具有成本低、降解完全、工藝簡單、無二次污染等明顯優(yōu)勢，得到了廣泛的應用[11～14]。為此，本研究對降解磺化瀝青的菌株進行了篩選與鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

磺化瀝青粉和鉆井泥漿由新疆克拉瑪依某油田提供，原材料及水溶液狀態(tài)分別如圖1、圖2所示。菌種來源于新疆克拉瑪依油田鉆井泥漿。

篩選培養(yǎng)基配方：硝酸鈉1.5g、硫酸銨1.5g、磷酸氫二鉀1.0g、七水硫酸鎂0.5g、氯化鉀0.5g、氯化鈉5.0g、七水硫酸亞鐵0.01g、氯化鈣0.02g、超純水1L、聚磺物(瀝青)(0.05%)0.5g。

富集培養(yǎng)基配方：牛肉膏5g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，瓊脂20g，超純水1L，pH=7。

1.2 菌種篩選

1)菌種的初篩 將采自于新疆克拉瑪依油田內(nèi)的鉆井泥漿，稱取1g接入到篩選培養(yǎng)基中。以5d為1個周期，馴化培養(yǎng)5個周期后進行稀釋平板涂布。馴化條件為35℃、150r/min。挑選菌落大小和顏色有差異的菌株作為初篩菌種。

2)菌種的復篩 將初篩菌落先接種至富集培養(yǎng)基在條件為35℃、150r/min進行富集擴大培養(yǎng)，吸取1mL富集菌液回接到液體篩選培養(yǎng)基中以5d為1個周期，馴化培養(yǎng)5個周期后，挑選生長良好的單菌落培養(yǎng)液進行稀釋涂布至固體篩選培養(yǎng)基上進行純化，再經(jīng)顯微鏡觀察菌株形態(tài)，得到菌落形態(tài)不同和菌體形態(tài)存在差異的復篩菌株。

圖1 磺化瀝青圖2 磺化瀝青水溶液

1.3 DNA提取

將篩選的菌種接到裝有固體富集培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，生長48h后，挑選其中一個單菌落進行DNA提取。DNA提取方法為微波提取法，接一環(huán)菌落到裝有50μL無菌水的EP管中，混勻。微波中火加熱2 min后快速取出冰浴2min。

1.4 PCR擴增

16s rDNA上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3’，下游引物1492R：5’-TACGGTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR 擴增體系為50μL：2×Taq PCR Master Mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板4μL，無菌水17μL。擴增程序為：94℃預變性4min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳后送于生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選結果

將馴化的混合菌液稀釋涂布進行初篩獲得135個長勢良好的單菌落。再經(jīng)回接、純化和形態(tài)觀察進行復篩，得到6株生長狀態(tài)優(yōu)良的單菌落。挑選其中生長速度最快且長勢最佳的菌株作為試驗菌，命名為X2。

2.2 菌種的形態(tài)學鑒定

X2菌種菌落呈圓形，表面光滑，白色。挑選單菌落進行染色后觀察，發(fā)現(xiàn)X2呈桿狀，為革蘭氏陽性菌。結果如圖3和圖4所示。

圖3 X2單菌落圖4 X2菌株鏡檢圖

2.3 菌種的分子生物學鑒定

將菌種X2進行PCR擴增，擴增樣品經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測序，得到以下片段：

圖5 菌株X2系統(tǒng)發(fā)育樹

將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行blast對比，結果顯示X2菌株的DNA與FJ938121.1_Bacillus_sp._210_10菌株的相似度高達99.79%，構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示，可以判定菌種X2屬芽孢桿菌屬(Bacillus)。

3 小結

經(jīng)過初篩和復篩得到6株優(yōu)良單菌，挑選其中1株長勢最佳的菌株(命名為X2)進行形態(tài)觀察及分子鑒定，判定菌種X2屬芽孢桿菌屬(Bacillus)。本研究結果為進一步的降解研究奠定了基礎。