肖笛，趙天鎖，俞鳴△

胰腺癌是世界范圍內(nèi)第4大惡性消化道腫瘤，5年總體生存率不足7%［1］。究其原因，是由于絕大部分胰腺癌患者發(fā)生了淋巴結(jié)和/或遠端器官轉(zhuǎn)移［2］。上皮特異性ETS 轉(zhuǎn)錄因子3（ESE3）定位于染色體11p12，在上皮細胞中特異性地表達［3］。目前，在多種惡性腫瘤中，ESE3 均被認(rèn)為是抑癌基因，其同時作為核轉(zhuǎn)錄因子，可以特異地識別GGAA/T序列，調(diào)控下游靶基因的表達，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要功能［4］。胰腺癌實體腫瘤常處于乏氧微環(huán)境中，有文獻報道胰腺癌亦處于低糖微環(huán)境之中［5］。但是胰腺癌細胞ESE3 表達水平在乏氧和低糖壓力刺激下的變化目前尚鮮見報道。本研究旨在探討乏氧和低糖微環(huán)境中ESE3對胰腺癌細胞侵襲的影響，為胰腺癌的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 患者標(biāo)本 收集2005年1月—2014年10月在天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院經(jīng)組織病理學(xué)診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）且接受根治性手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本99例，其中包含鄰近正常胰腺組織標(biāo)本16例。所有患者術(shù)前均未經(jīng)化療或放療，隨訪至2017年1月。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理道德委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 細胞與試劑 人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1、SW1990由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所保存。常規(guī)DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清均購于Gibco（美國）公司；ESE3 及其空白對照慢病毒購于上海吉瑪基因；嘌呤霉素購于InvivoGen 公司（美國）；基質(zhì)膠購自BD Bioscience（美國）；Transwell 小室購自Corning公司（美國）；核-漿分離試劑盒與BCA 蛋白定量試劑盒購于Thermo Fisher Scientific（美國）；兔抗人ESE3多克隆抗體購自LifeSpan BioSciences（美國）；免疫組化試劑盒、鼠抗人HIF-1α 單克隆抗體和兔抗人GRP78 多克隆抗體購自Abcam 公司（英國）；鼠抗人β-antin、β-Tublin和Lamin B1 單克隆抗體以及兔抗人α-Tublin 多克隆抗體購自武漢三鷹公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化分析ESE3表達水平及判定方法 按照免疫組化試劑盒說明書將入組的99例標(biāo)本的組織芯片經(jīng)脫蠟、梯度乙醇水化、蒸餾水以及抗原修復(fù)后，加50μL 的ESE3 抗體（1∶200稀釋），4 ℃過夜孵育后滴加二抗，室溫孵育1 h，DAB顯色后光鏡下觀察表達水平。根據(jù)ESE3陽性細胞染色強度和百分比進行半定量評分。染色強度評分為0（陰性）、1（低）、2（中）、3（高）。陽性細胞百分比評分為0（無染色）、1（1%～25%染色）、2（26%～50%染色）、3（51%～100%染色）。最終染色評分通過強度評分×面積評分來確定，范圍0～9。最終評分低于5被認(rèn)為陰性或低表達，5～9被認(rèn)為中高表達。

1.2.2 TCGA 數(shù)據(jù)庫驗證腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤大小與ESE3 mRNA 表達水平的關(guān)系 選取TCGA 數(shù)據(jù)庫（http://www.cbioportal.org/）中147例PDAC 患者的臨床資料，并對患者ESE3 mRNA 表達水平進行歸一化處理［6］，按照有無淋巴結(jié)和/或器官轉(zhuǎn)移，分為轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組；同時以3 cm為截斷值［7］將PDAC 患者分為腫瘤≥3 cm 組和腫瘤＜3 cm 組，驗證腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤大小與ESE3 mRNA表達水平的關(guān)系。

1.2.3 構(gòu)建PANC-1 過表達ESE3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系 利用慢病毒載體在低內(nèi)源ESE3 表達的PDAC 細胞系PANC-1 中特異性的過表達ESE3，嘌呤霉素（1 g/L）篩選48 h 后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系。并應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡法對轉(zhuǎn)染效率進行驗證。轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細胞記為pCDH-Vector，轉(zhuǎn)染過表達ESE3 質(zhì)粒的細胞記為pCDH-ESE3。

1.2.4 細胞遷移實驗檢測PANC-1 細胞侵襲能力 使用鋪有1∶5 稀釋的基質(zhì)膠的Transwell 小室進行細胞遷移能力測定，用含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，每個上室分別加入2×105個PANC-1 和PANC-1 過表達ESE3 細胞，含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基加入下室中，分別在常氧、乏氧和低糖條件下孵育細胞36 h，將遷移至小室底部的細胞使用三步染色法染色。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測ESE3、HIF-1α、GRP78表達情況 使用含10%胎牛血清的常規(guī)DMEM 培養(yǎng)基和含10%胎牛血清的低糖DMEM 培養(yǎng)基（含葡萄糖1 000 mg/L）培養(yǎng)PANC-1、SW1990細胞，放置于37 ℃、5%CO2的空氣濕潤的孵箱中0、6、12 h；乏氧處理時將細胞放置入乏氧孵箱中（0.1%O2、5%CO2和N2平衡氣中）37 ℃孵育，分別培養(yǎng)0、6、12 h。PANC-1、SW1990細胞經(jīng)預(yù)冷PBS沖洗2遍后加入含有蛋白酶抑制劑的十二烷基磺酸鈉（SDS）細胞裂解液，研磨裂解取總蛋白，100 ℃加熱10 min。按照核-漿分離試劑盒說明書步驟提取上述乏氧和低糖條件下PANC-1、SW1990細胞的核蛋白與漿蛋白。HIF-1α、GRP78 分別作為乏氧和低糖的標(biāo)志蛋白，Lamin B1作為核蛋白內(nèi)參，α-Tubulin作為漿蛋白內(nèi)參，β-actin或β-Tublin作為總蛋白內(nèi)參。BCA法進行蛋白定量后每孔上樣20μg 于10%SDS-PAGE 電泳分離，以260 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF 膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，使用相應(yīng)的抗體檢測目的蛋白，ECL曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 6 軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）或M（P25，P75）表示，組間比較采用t檢驗、秩和檢驗或方差分析。多重比較用SNK-q檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。使用Kaplan-Meier 法估計不同ESE3 表達者的累積生存率，并用Log-rank法比較總生存率的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESE3蛋白在胰腺癌組織中的表達情況 99例胰腺癌組織ESE3 中高表達64例（64.65%），低表達35例（35.35%）；16例正常胰腺組織中ESE3 中高表達12例（75.00%），低表達4例（25.00%）。與正常胰腺組織相比，胰腺癌組織中ESE3 的表達水平降低（χ2=8.959，P＜0.01），見圖1。

Fig.1 Results of the expression levels of ESE3 in tissues by optical microscope(immunohistochemistry stain,×200)圖1 光學(xué)顯微鏡觀察組織中ESE3的表達水平（免疫組化染色，×200）

2.2 胰腺癌中ESE3表達水平與預(yù)后的關(guān)系 結(jié)果表明，具有低表達ESE3的PDAC患者與高表達ESE3的PDAC 患者比較，總生存期（OS，14 個月vs.17 個月，HR=1.505，95%CI：1.042～2.600，Log-rankχ2=4.096，P=0.043）和無復(fù)發(fā)生存期（DFS，7 個月vs.11個月，HR=1.761，95%CI：1.280～3.316，Log-rankχ2=7.942，P=0.005）更短，見圖2。

Fig.2 OS curve and DFS curve with different ESE3 expression levels圖2 不同ESE3表達水平患者的OS曲線和DFS曲線圖

2.3 TCGA 數(shù)據(jù)庫驗證結(jié)果 轉(zhuǎn)移組患者的ESE3表達量低于非轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）；不同腫瘤大小組的ESE3表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

Tab.1 Comparison of ESE3 mRNA expression in different clinicopathological data in TCGA database表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中不同臨床病理資料中ESE3 mRNA表達量的比較 ［M（P25，P75）］

2.4 過表達ESE3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系驗證 實驗結(jié)果顯示，與空載質(zhì)粒相比，pCDH-ESE3 質(zhì)粒可有效增加PANC-1細胞中ESE3的蛋白表達，見圖3。

Fig.3 The verification of ESE3 overexpression cell line圖3 過表達ESE3穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系驗證結(jié)果

2.5 乏氧和低糖條件下過表達ESE3抑制胰腺癌細胞侵襲的能力 細胞遷移實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達ESE3抑制了PANC-1細胞的侵襲能力；而在乏氧和低糖條件下，過表達ESE3的PANC-1細胞的侵襲能力與常規(guī)條件培養(yǎng)的過表達ESE3 的PANC-1 細胞相比顯著增強（F=552.333，P＜0.01），見圖4。

2.6 胰腺癌細胞中ESE3 和HIF-1α、GRP78 表達的關(guān)系 結(jié)果表明，乏氧和低糖條件下的PANC-1 和SW1990 細胞系隨著處理時間的延長，ESE3 表達降低，HIF-1α、GRP78表達增加，見圖5A～D。PANC-1細胞過表達ESE3后，ESE3蛋白表達增加，同樣伴隨HIF-1α、GRP78 表達降低，見圖5E。乏氧和低糖條件下處理PANC-1、SW1990 胰腺癌細胞系12 h 后，在細胞核中ESE3表達降低，而HIF-1α、GRP78的表達增加，見圖5F～I。

3 討論

3.1 ESE3 在胰腺癌組織中低表達 有文獻報道，食管鱗狀細胞癌［8］和前列腺癌［9-10］的腫瘤組織中ESE3蛋白的表達缺失。在本研究中，考慮到用RT-qPCR檢測mRNA表達水平的不穩(wěn)定性，本文僅從蛋白水平觀察ESE3 在胰腺癌組織及胰腺癌細胞中的變化情況。發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中ESE3 蛋白表達水平比正常胰腺組織降低。為了進一步探討ESE3 的表達在PDAC進展中的意義，對患者ESE3表達水平與其臨床信息及病理資料之間的關(guān)系經(jīng)單因素分析，結(jié)果顯示ESE3 的表達缺失與胰腺癌的不良預(yù)后相關(guān)，這表明ESE3 低表達是影響胰腺癌患者OS 和DFS 的危險因素。TCGA 數(shù)據(jù)庫證實腫瘤的轉(zhuǎn)移與ESE3 的表達水平密切相關(guān)，因此，ESE3蛋白表達的缺失在胰腺癌的進展過程中起重要的作用。此外，同樣發(fā)現(xiàn)了支持ESE3 作為胰腺癌抑癌基因的有力證據(jù)，使用ESE3穩(wěn)定過表達的PANC-1細胞系來評估其侵襲能力的改變，發(fā)現(xiàn)ESE3的過表達可以抑制PANC-1細胞的侵襲能力。

Fig.4 Overexpression of ESE3 under hypoxic and glucose deprived conditions inhibited the invasion of PDAC cells(×100)圖4 在乏氧和低糖條件下過表達ESE3抑制胰腺癌細胞侵襲的能力降低（×100）

Fig.5 The relationship between the expression of ESE3 and HIF-1α,GRP78 in PDAC cell line圖5 胰腺癌細胞中ESE3和HIF-1α、GRP78表達的關(guān)系

3.2 乏氧和低糖可以降低ESE3抑制胰腺癌細胞的侵襲能力 胰腺癌組織一般處于乏氧和低糖的腫瘤微環(huán)境中，Zhu 等［11］課題組證實了胰腺導(dǎo)管腺癌組織中存在HIF-1α過表達，并且其過表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。乏氧可以通過激活核轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α 改變下游靶基因的轉(zhuǎn)錄水平［12］。另一方面，與正常細胞相比，腫瘤細胞對葡萄糖的攝取及代謝均處于增高狀態(tài)，糖代謝的增加是許多惡性腫瘤的顯著特征［5］。同時胰腺癌組織中HIF-1α、GRP78的過表達可以提高血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和成纖維細胞生長因子（FGF）的表達，從而促進腫瘤血管的新生，并與胰腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)［13］。為了在體外進一步了解ESE3 在乏氧和低糖條件下對胰腺癌細胞侵襲作用的影響，本研究對過表達ESE3的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系進行乏氧和低糖條件處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與pCDH-ESE3組相比，乏氧和低糖條件下的pCDH-ESE3胰腺癌細胞系的侵襲能力有所增強，提示乏氧和低糖微環(huán)境中ESE3的變化可能與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。隨后，使用蛋白質(zhì)免疫印跡法觀察到在乏氧和低糖條件下ESE3總蛋白的表達水平降低，同時伴隨HIF-1α、GRP78總蛋白表達水平增高；使用pCDH-ESE3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PANC-1 細胞系后，隨著ESE3 總蛋白的增加HIF-1α、GRP78總蛋白的表達下調(diào)。

由于ESE3作為核轉(zhuǎn)錄因子，在細胞核中執(zhí)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，直接調(diào)控下游靶基因，有文獻報道，ESE3可以直接結(jié)合并調(diào)控E-cadherin 的啟動子區(qū)，促進其表達，影響腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移［14］。為了驗證在乏氧和低糖條件下ESE3 蛋白在細胞核中的表達是否發(fā)生變化，本研究使用了核漿分離方法，結(jié)果表明ESE3蛋白在細胞核中表達降低，也伴隨著與HIF-1α、GRP78在細胞核中的表達水平增高。

綜上所述，在胰腺癌組織中ESE3表達水平顯著低于正常胰腺組織。此外，ESE3表達水平的降低與胰腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，低表達ESE3的胰腺癌患者預(yù)后不良。另在胰腺癌細胞系中，證實乏氧和低糖條件可以降低ESE3蛋白的表達，從而促進胰腺癌細胞系的侵襲，且ESE3與HIF-1α、GRP78呈負性表達關(guān)系。但乏氧和低糖引起ESE3 表達降低的具體機制還有待進一步研究，期望今后隨著本課題組對胰腺癌腫瘤微環(huán)境中各個組分及分子機制之間的深入研究，為腫瘤治療能提供更新的思路與方法。