李長(zhǎng)春，王 永，姚國(guó)新，戴余軍，李國(guó)元

(1. 湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000；2. 特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 孝感 432000)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬果蠅(Drosophilasimulans)由湖北大學(xué)行為生態(tài)與進(jìn)化生物學(xué)研究中心提供。Pb(NO3)2·3H2O、CdCl2·2.5H2O購(gòu)自天津市風(fēng)船科技有限公司，均為分析純。蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒(考馬斯亮藍(lán)法)、總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶測(cè)定試劑盒購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。恒溫光照培養(yǎng)箱(MJX-2508-Z)由上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)，全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(Enspire)購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2 果蠅的飼養(yǎng)

果蠅培養(yǎng)于5 cm×12 cm平底玻璃試管中。置于(23±1)°C，相對(duì)濕度60 %～80 %，光周期14 h:10 h (L/D)的恒溫光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基配方為：玉米粉62.5 g，紅糖50.0 g，酵母粉7.5 g，瓊脂粉5.0 g，苯甲酸鈉0.1 g，丙酸2 mL，雙蒸水500 mL。

1.3 果蠅的染毒處理

通過(guò)向培養(yǎng)基添加Pb2+、Cd2+水溶液使果蠅染毒。設(shè)置鉛、鎘單一污染濃度各2個(gè)：10 mg/L Pb2+(Pb10)、20 mg/L Pb2+(Pb20)和10 mg/L Cd2+(Cd10)、20 mg/L Cd2+(Cd20)；鉛鎘復(fù)合污染濃度2個(gè)：10 mg/L Pb2++ 10 mg/L Cd2+(PC10)，20 mg/L Pb2++ 20 mg/L Cd2+(PC20)；未添加鉛鎘的培養(yǎng)基作對(duì)照(CK)。每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)。乙醚麻醉后，收集從無(wú)污染培養(yǎng)基上8 h內(nèi)孵化出的果蠅成蟲(chóng)接種于培養(yǎng)基含鎘的培養(yǎng)瓶和對(duì)照瓶中，每瓶接種雌雄果蠅各10只，5 d后清除果蠅成蟲(chóng)。每處理6次重復(fù)。

1.4 生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的測(cè)定

每天早上8:00定時(shí)檢查，記錄每管果蠅開(kāi)始化蛹和開(kāi)始羽化時(shí)間；分別在各管出現(xiàn)第1個(gè)蛹和成蟲(chóng)后的第5天記錄各管成蛹的個(gè)數(shù)和羽化的果蠅數(shù)；接種后第10天后每組隨機(jī)選取10頭幼蟲(chóng)稱重，羽化當(dāng)天隨機(jī)選擇各組雌雄成蟲(chóng)各10只稱重。性別比 = 雌果蠅數(shù)/果蠅總數(shù)。

1.5 酶活性的測(cè)定

隨機(jī)收集成熟后第2天的雌雄果蠅，麻醉后稱取0.1 g，加入質(zhì)量(g) ：體積(mL) 9倍的預(yù)冷的生理鹽水，置冰水混合物上研磨勻漿。4 ℃下，3000 r/min，離心10 min，取上清液。加入4倍體積生理鹽水得濃度為2 %的組織勻漿，作為待測(cè)液。樣本蛋白質(zhì)含量、總抗氧化能力(T-AOC)、SOD和CAT活性用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒測(cè)定。每毫克蛋白每分鐘使反應(yīng)體系的吸光度增加0.01定義為一個(gè)總抗氧化能力單位；反應(yīng)體系中SOD抑制率達(dá)50 %時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量定義為一個(gè)SOD活力單位；每毫克蛋白每分鐘內(nèi)催化降解1 nmol H2O2定義為一個(gè)CAT活力單位。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用Mean±SE表示。不同處理間的差異采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。不同處理間平均數(shù)的差異顯著性采用最小顯著差數(shù)法(1east significant difference, LSD)進(jìn)行比較。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb2+、Cd2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的影響

Pb2+、Cd2+單一及復(fù)合處理顯著延長(zhǎng)了果蠅的化蛹時(shí)間和羽化時(shí)間，不同處理間，化蛹時(shí)間(F=20.937，df=6，P<0.001)和羽化時(shí)間(F=43.259，df=6，P<0.001)差異顯著。相同濃度下，Cd2+單一處理時(shí)幼蟲(chóng)化蛹時(shí)間和羽化時(shí)間大于Pb2+單一處理，Pb2+、Cd2+復(fù)合處理時(shí)幼蟲(chóng)化蛹時(shí)間和羽化時(shí)間大于Pb2+、Cd2+單一處理。10 mg/L Cd2+與20 mg/L Pb2+單一處理組之間(P=0.156)，10 mg/L Cd2+單一處理與10 mg/L Pb2++10 mg/L Cd2+復(fù)合處理組之間(P=0.334)，以及20 mg/L Cd2+單一處理與20 mg/L Pb2++20 mg/L Cd2+復(fù)合處理組之間果蠅化蛹時(shí)間的差異不顯著(P=0.625)。10 mg/L Pb2+與20 mg/L Pb2+單一處理組之間(P=0.082)，10 mg/L Cd2+、20 mg/L Cd2+單一處理和10 mg/L+10 mg/L 鉛鎘復(fù)合處理組之間果蠅羽化時(shí)間的差異不顯著(P=0.096，表1)。

表1 Pb2+、Cd2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的影響

注：平均數(shù)的多重比較采用LSD法。標(biāo)注不同字母表示不同處理間差異性顯著(P<0.05)。

Note: LSD method was used for multiple comparisons of means. Different letters above columns indicate significant difference among treatments (P<0.05).

Pb2+、Cd2+單一及復(fù)合處理明顯降低了果蠅體重，幼蟲(chóng)體重(F=65.343，df=6，P<0.001)、雌果蠅體重(F=19.626，df=6，P<0.001)和雄果蠅體重(F=26.095，df=6，P<0.001)受重金屬脅迫差異顯著。Pb2+、Cd2+單一脅迫時(shí)，果蠅體重隨濃度的增大顯著降低，相同濃度Cd2+脅迫時(shí)果蠅成蟲(chóng)體重顯著低于Pb2+脅迫時(shí)體重，20 mg/L Pb2+單一處理、10 mg/L Cd2+單一處理、10 mg/L +10 mg/L鉛鎘復(fù)合處理之間雌雄果蠅體重差異不顯著，20 mg/L Pb2+、Cd2+復(fù)合處理和20 mg/L Cd2+單一處理間差異不顯著(P<0.05，表1)。

2.2 Pb2+、Cd2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)果蠅對(duì)果蠅性別比的影響

Pb2+、Cd2+單一和復(fù)合脅迫對(duì)果蠅的性別比產(chǎn)生了顯著影響(F=15.734，df=6，P<0.001，圖1)。10 mg/L Pb2+、Cd2+單一和復(fù)合脅迫對(duì)果蠅的性別比沒(méi)有顯著影響(P=0.164)。20 mg/L Pb2+、Cd2+單一和復(fù)合脅迫下果蠅的性別比顯著高于對(duì)照(P<0.01)，且20 mg/L Pb2++ 20 mg/L Cd2+復(fù)合脅迫和20 mg/L Cd2+脅迫時(shí)果蠅性別比顯著高于20 mg/L Pb2+脅迫時(shí)果蠅的性別比(P<0.01)。

平均數(shù)的多重比較采用LSD法。標(biāo)注不同字母表示不同處理間差異性顯著(P<0.05)LSD method was used for multiple comparisons of means. Different letters above columns indicate significant difference among treatments (P<0.05)圖1 Pb2+、Cd2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)果蠅性別比的影響Fig.1 Effects of single and combined pollution of Pb2+ and Cd2+ on sex ratio of Drosophila simulans

2.3 Pb2+、Cd2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)果蠅抗氧化能力的影響

Pb2+、Cd2+單一和復(fù)合脅迫顯著抑制了雌雄果蠅T-AOC、SOD和CAT的活性(圖2)，不同處理間果蠅T-AOC活性(雌：F=95.836，df=6，P<0.001；雄：F=210.101，df=6，P<0.001)、SOD活性(雌：F=82.557，df=6，P<0.001；雄：F=244.559，df=6，P<0.001)和CAT活性(雌：F=39.219，df=6，P<0.001；雄：F=6，df=6，P<0.001)差異顯著。雌雄果蠅10和20 mg/L Pb2+單一處理間T-AOC活性差異不顯著，10 mg/L Pb2+、Cd2+復(fù)合處理T-AOC活性顯著低于10 mg/L Pb2+單一處理，高于10 mg/L Cd2+單一處理，隨著濃度升高，20 mg/L Pb2+、Cd2+復(fù)合處理T-AOC活性明顯低于對(duì)應(yīng)的單一處理(P<0.05)。Pb2+、Cd2+單一及復(fù)合處理下，果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性變化趨勢(shì)相同，單一處理?xiàng)l件下，果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性分別隨Pb2+和Cd2+濃度的增大而顯著降低，10和20 mg/L Pb2+、Cd2+復(fù)合處理時(shí)，SOD和CAT活性顯著低于對(duì)應(yīng)的單一處理(P<0.05)。

3 討 論

果蠅是毒理學(xué)研究中有重要潛在價(jià)值的模式生物[12]，然而目前研究較多的是黑腹果蠅Drosophilamelanogaster，關(guān)于擬果蠅的報(bào)道很少。有研究指出重金屬脅迫可顯著抑制果蠅D.melanogaster的生長(zhǎng)、繁殖[13]。本研究中，Pb2+、Cd2+單一和復(fù)合脅迫下，果蠅的化蛹時(shí)間和羽化時(shí)間顯著延長(zhǎng)，蛹重和成蟲(chóng)體重顯著下降，且表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，此結(jié)果表明，擬果蠅可以對(duì)Pb2+、Cd2+污染提供較好的指示作用。重金屬可以與細(xì)胞內(nèi)的分子直接作用，影響其正常的活性和生理功能，還可以通過(guò)引起細(xì)胞內(nèi)ROS的過(guò)量產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生間接損傷[10]。生物體可以對(duì)重金屬脅迫進(jìn)行有效的抵御，但是以降低其生長(zhǎng)發(fā)育為代價(jià)的[14]。相同濃度的Cd2+對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育和抗氧化能力的影響顯著高于Pb2+，表明Cd2+比Pb2+對(duì)果蠅有更大的毒性。在Pb2+、Cd2+濃度相同的情況下，復(fù)合脅迫比單一脅迫對(duì)果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育和抗氧化能力的抑制作用更強(qiáng)，說(shuō)明二者具有協(xié)同作用，加大了對(duì)果蠅的毒害[15-16]，進(jìn)一步證實(shí)復(fù)合污染下兩種或多種有毒物質(zhì)對(duì)生物體的毒害效應(yīng)與單一物質(zhì)有所不同[4,17]。

A.總抗氧化能力；B. 超氧化物歧化酶；C.過(guò)氧化氫酶。平均數(shù)的多重比較采用LSD法。標(biāo)注不同大寫字母表示雌果蠅不同處理間差異性顯著，不同小寫字母表示雄果蠅不同處理間差異性顯著(P<0.05)A. T-AOC；B. SOD；C. CAT. LSD method was used for multiple comparisons of means, Different uppercase letters and lowercase letters denote a significant difference among females and males, respectively (P<0.05)圖2 Pb2+、Cd2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)果蠅抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of single and combined pollution of Pb2+ and Cd2+ on antioxidant capacity of Drosophila simulans

重金屬脅迫下，不同生物在不同的情況下會(huì)采取不同的抗氧化策略。蟲(chóng)體內(nèi)SOD、CAT等抗氧化酶活性增強(qiáng)或抑制的現(xiàn)象都有報(bào)道，酶活性變化特點(diǎn)與物種類型、發(fā)育階段、性別，以及重金屬的種類、濃度、形態(tài)和作用時(shí)間等因素有關(guān)[18]。如，舞毒蛾Lymantriadispar在不同發(fā)育階段采取不同抗氧化策略抵御Cd2+造成的脅迫，飼料中添加50 μg Cd/g干重時(shí)，舞毒蛾各齡期幼蟲(chóng)SOD活性相比對(duì)照組沒(méi)有顯著變化，CAT活性在3齡期顯著下降，在6齡期顯著升高[19]。中華稻蝗Oxyachinensis幼蟲(chóng)在Cr6+脅迫下SOD活性隨處理濃度變化不明顯，CAT、GPx活性隨Cr6+濃度增加呈先增加后降低的趨勢(shì)[20]。低濃度的鎘可以刺激文哈Meretrixmeretrix體內(nèi)SOD和CAT活性的提高，但高濃度的鎘則抑制它們的活性[21]。本研究中，果蠅體內(nèi)的總抗氧化能力T-AOC，以及SOD和CAT 的活性均表現(xiàn)為抑制現(xiàn)象，且與脅迫的重金屬濃度相關(guān)，可能與果蠅持續(xù)受到高濃度重金屬脅迫有關(guān)，這與陳壁鋒等[22]研究結(jié)果，黑腹果蠅體內(nèi)SOD活性隨Pb2+濃度升高而降低相似。說(shuō)明昆蟲(chóng)抗氧化系統(tǒng)抵御氧化脅迫的能力是有限的，低劑量的重金屬可以誘導(dǎo)蟲(chóng)體抗氧化基因的表達(dá)，高劑量重金屬的持續(xù)脅迫則會(huì)造成抗氧化系統(tǒng)的破壞[23]。

4 結(jié) 論

Cd2+比Pb2+單一或復(fù)合脅迫顯著抑制果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育和抗氧化能力。相同濃度Cd2+比Pb2+對(duì)果蠅的毒害作用更大，相同濃度的Pb2+、Cd2+復(fù)合脅迫對(duì)果蠅的毒害作用高于單一脅迫。