袁 遠(yuǎn)，高 熹，張連根，倪 峰，高 儼，吳毅歆，喜 超，朱家位*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201；2.云南高原特色產(chǎn)業(yè)研究院，云南 昆明 650201)

【研究意義】細(xì)胞色素P450單加氧酶系統(tǒng)是主要的解毒酶系統(tǒng)之一，其參與昆蟲(chóng)中對(duì)各種生物殺蟲(chóng)劑體內(nèi)反應(yīng)及昆蟲(chóng)自身化學(xué)組成的新陳代謝。細(xì)胞色素P450是一種促使電子從NADPH向P450氧化還原劑[1-2]。【前人研究進(jìn)展】昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450于1967年由Ray首先發(fā)現(xiàn)[3]。目前，已研究了20多種昆蟲(chóng)的細(xì)胞色素P450。研究表明P450在昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用，昆蟲(chóng)產(chǎn)生殺蟲(chóng)劑抗藥性的重要原因是由于一個(gè)或幾個(gè)P450基因過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致P450解毒酶量的增加導(dǎo)致體內(nèi)單加氧酶系介導(dǎo)的代謝反應(yīng)，從而引起昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性[4]。近年來(lái)，細(xì)胞色素P450新基因被不斷克隆其結(jié)構(gòu)，其表達(dá)調(diào)控、抗性關(guān)系的研究取得了一定的進(jìn)展[5]。P450酶系統(tǒng)在昆蟲(chóng)體內(nèi)多種內(nèi)源物的代謝中起到至關(guān)重要的作用，同時(shí)參與昆蟲(chóng)體內(nèi)激素等物質(zhì)的生物合成和降解[6-7]以及脫皮素平衡的多個(gè)步驟[8]。甜菜夜蛾Spodopteraexigua是中國(guó)危害嚴(yán)重的害蟲(chóng)之一，多年來(lái)對(duì)于甜菜夜蛾的防治手段主要是依靠化學(xué)防治。但是，長(zhǎng)期濫用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致甜菜夜蛾對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生了很強(qiáng)的抗藥性。研究該害蟲(chóng)抗藥性機(jī)制，將有助于對(duì)該害蟲(chóng)進(jìn)行有效的防治?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以甜菜夜蛾為研究對(duì)象，采用RACE技術(shù)，克隆甜菜夜蛾細(xì)胞色素P450基因，并利用生物學(xué)軟件對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為探究甜菜夜蛾產(chǎn)生抗藥性的機(jī)理提供分子依據(jù)，同時(shí)為其他學(xué)者研究昆蟲(chóng)P450基因提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)

甜菜夜蛾成蟲(chóng)采自云南省昆明市斗南玫瑰種植基地，供作試驗(yàn)用蛾。

1.2 總RNA的抽提

供試蟲(chóng)體的總RNA提取采用王玉成等方法[9]。

1.3 RACE

以新鮮抽提的甜菜夜蛾總RNA為材料，利用CLONTECH公司的Smarttm RACE cDNA Amplification Kit，合成3′和5′ RACE cDNA模板。根據(jù)細(xì)胞色素P450保守結(jié)構(gòu)域序列，設(shè)計(jì)基因特異性3′ RACE簡(jiǎn)并引物(3′ RACE gene-specific primer，3′ GSP)，使用RACE試劑盒中的UPM引物，通過(guò)PCR獲得P450的3′端序列，依據(jù)獲得的3′端序列設(shè)計(jì)基因特異性5′引物擴(kuò)增獲得5′端序列。具體方法及步驟采用朱家穎等方法[10]。

1.4 克隆及序列測(cè)定

1.4.1 連接反應(yīng) 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收液與Pmd19-T載體進(jìn)行連接后，室溫?fù)嵊? h，4 ℃過(guò)夜。反應(yīng)體系：pMD19-T (50 ng/μl) 1 μl，Solution I 5 μl，PCR純化產(chǎn)物 4 μl，總體積10 μl。

1.4.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備 采用CaCl2法[11]制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

1.4.3 轉(zhuǎn)化和篩選 取感受態(tài)細(xì)胞100 μl加入10 μl連接物，冰浴30 min。42 ℃水浴熱激90 s立刻置于冰上10 min，加入預(yù)冷LB培養(yǎng)液900 μl。37 ℃搖床低速培養(yǎng)1 h后3000 r/min離心30 s，吸去上清至剩余200 μl，將沉淀輕輕懸浮。取懸浮液100 μl涂布在含Amp(50～100 mg/mL)的LB平板(先涂布4 μl 200 mg/LIPTG和40 μl 20 mg/mLX-Gal)靜置30 min，待菌液被完全吸收后37 ℃倒置培養(yǎng)16 h。當(dāng)出現(xiàn)明顯而又未重疊的單菌落時(shí)，拿出平板篩選白色單菌落置5 mL含Amp(50～100 mg/mL)的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)8～12 h，菌液渾濁，4 ℃保存。

“*”星號(hào)表示終止子The asterisk marked the translation-termination codon圖1 SexiP450基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequences of SexiP450 and deduced amino acid sequences

1.4.4 送檢測(cè)序 含目的片段質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂平板后通過(guò)藍(lán)白斑篩選以及菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性重組克隆，菌液送公司測(cè)序。

1.5 序列分析

核苷酸的翻譯和氨基酸比對(duì)使用Genetyx-min 5.1和ClustalX 1.83軟件分析[12]。蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)使用SignalP在線分析工具[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA克隆及序列分析

將3′和5′ RACE擴(kuò)增所得目的基因片段拼接后，得甜菜夜蛾色素細(xì)胞P450基因的全長(zhǎng)序列為894 bp，開(kāi)放閱讀框411 bp，3′和5′端非編碼序列分別為79和213 bp，命名為SexiP450(圖1)。該基因編碼194個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的氨基酸序列編碼194個(gè)氨基酸。SignalP預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)的分子量為22.30 kDa，等電點(diǎn)為8.22，該蛋白無(wú)信號(hào)肽序列(圖2)。

2.2 同源性比較和分析

SexiP450與其它昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因的氨基酸序列ClustalX對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖可見(jiàn)，其中與斜紋夜蛾Spodopteralitura、甘藍(lán)夜蛾Mamestrabrassicae、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera和谷實(shí)夜蛾Helicoverpazea細(xì)胞色素P450的相似性分別為42 %、41 %、39 %和42 %。

圖2 蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析Fig.2 Analysis of signal peptide protein

3 討 論

細(xì)胞色素P450基因在昆蟲(chóng)抗藥性及對(duì)寄主植物適應(yīng)性中的重要作用引起了廣大學(xué)者的重視。目前NCBI中己報(bào)道了多個(gè)昆蟲(chóng)的P450基因序列，如赤擬谷盜[14]、家蠶[15]、黑腹果蠅[16]、意大利蜜蜂[17]、麗蠅蛹集金小蜂[18]、人虱[19]等。昆蟲(chóng)細(xì)胞色素p450基因的研究從目標(biāo)昆蟲(chóng)中克隆獲得一個(gè)細(xì)胞色素P450基因的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行分析，目前已有大量有關(guān)細(xì)胞色素P450基因的研究報(bào)道[5,20]。本研究利用RACE技術(shù)，從甜菜夜蛾中克隆獲得一個(gè)細(xì)胞色素P450基因的全長(zhǎng)cDNA序列，根據(jù)其cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列表明，SexiP450特征：相對(duì)分子量為22.30 kDa，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)并無(wú)信號(hào)肽。近年隨著基因組學(xué)的不斷發(fā)展，許多細(xì)胞色素P450基因逐漸從昆蟲(chóng)基因組中被發(fā)掘。據(jù)此，更多的甜菜夜蛾細(xì)胞色素P450基因有待克隆獲得。同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，甜菜夜蛾細(xì)胞色素P450基因與其它昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因在氨基酸水平上與同目昆蟲(chóng)的相似性很高，而與其他目的昆蟲(chóng)的相對(duì)比較低一些。細(xì)胞色素P450基因結(jié)構(gòu)多樣、分布廣泛、功能復(fù)雜及基因調(diào)控性多樣，隨著基因組學(xué)的發(fā)展越來(lái)越受到學(xué)界的廣泛關(guān)注，其在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、取食等過(guò)程中的作用正逐步被解開(kāi)，本研究結(jié)果為科研人員深入探究昆蟲(chóng)P450基因結(jié)構(gòu)與功能提供了方法借鑒。隨著對(duì)P450研究的深入其與昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性之間的分子機(jī)理必將會(huì)被人類揭示。

相同和相似的氨基酸分別用黑色和灰色標(biāo)出。Sexi為斜紋夜蛾(AAP80766)，Mbra為甘藍(lán)夜蛾(AAR26518)，Harm為棉鈴蟲(chóng)(AAV28704)，Hzea為谷實(shí)夜蛾(ABH09252)The identical and similar amino acids mark in dark and grey. Sexi is Spodoptera litura (AAP80766); Mbra is Mamestra brassicae (AAR26518); Harm is Helicoverpa armigera (AAV28704); Hzea is Helicoverpa zea (ABH09252)圖2 SexiP450與其它昆蟲(chóng)P450基因的氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Amino acid sequence alignment between SexiP450 and other insects’ cytochrome P450 gene

4 結(jié) 論

利用RACE技術(shù)，從甜菜夜蛾中克隆獲得1個(gè)細(xì)胞色素P450基因的全長(zhǎng)cDNA序列，大小為894 bp，開(kāi)放閱讀框411 bp，3′和5′端非編碼序列分別為79和213 bp，編碼194個(gè)氨基酸。利用SignalP，Genetyx-min 5.1和ClustalX生物信息學(xué)軟件對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)顯示該蛋白無(wú)信號(hào)肽序列，其氨基酸序列比對(duì)與斜紋夜蛾、甘藍(lán)夜蛾、棉鈴蟲(chóng)和谷實(shí)夜蛾細(xì)胞色素P450的相似性分別為42 %、41 %、39 %和42 %。通過(guò)對(duì)該基因的分析預(yù)測(cè)可為探究甜菜夜蛾產(chǎn)生抗藥性的機(jī)理提供參考，同時(shí)為其他學(xué)者研究昆蟲(chóng)P450基因提供借鑒和參考。