張 杰，劉 悅，羅慧琳，張 橋*

(1.齊魯醫(yī)藥學(xué)院 細(xì)菌耐藥與微生物分子系統(tǒng)學(xué)研究室，山東 淄博 255000；2.齊魯醫(yī)藥學(xué)院護(hù)理學(xué)院，山東 淄博 255000；3.齊魯醫(yī)藥學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)，山東 淄博 255000)

【研究意義】?jī)?nèi)生真菌是一個(gè)具有豐富多樣性的生物類群，是人類進(jìn)行趨利性開(kāi)發(fā)和利用的重要的真菌資源，在各類植物體內(nèi)廣泛分布。植物內(nèi)生真菌(endophyte)最早由Debary(1866年)[1]提出，鑒于內(nèi)生真菌與宿主在長(zhǎng)期互作過(guò)程中與宿主形成了協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系，而沒(méi)有引發(fā)明顯的感染癥狀，致使關(guān)于內(nèi)生真菌方面的研究成果鮮有報(bào)道。自1993年，Strobel 等[2]從短葉紫杉(Taxusbrevifolia) 中分離獲得一株能產(chǎn)生紫杉醇(抗癌)的內(nèi)生真菌，越來(lái)越多的人們才逐漸意識(shí)到內(nèi)生真菌與宿主植物間在化學(xué)和生態(tài)學(xué)方面的協(xié)同性關(guān)系，并對(duì)有生物學(xué)活性的次生代謝產(chǎn)物投入了更多關(guān)注，使得尋找和利用藥用植物內(nèi)生真菌生產(chǎn)具有生物學(xué)活性物質(zhì)而成為微生物學(xué)和天然藥物化學(xué)研究和開(kāi)發(fā)的重要領(lǐng)域?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蛇足石杉[Huperziaserrata(Thunb.)Trev.]，別名蛇足石松、千層塔等，為石杉科石杉屬多年生蕨類草本植物。藥學(xué)研究表明，蛇足石杉全草含生物堿，其中的石杉?jí)A甲(Hup-A)及其類似物能選擇性抑制乙酰膽堿酶的活性[5]，因能起到提高學(xué)習(xí)記憶功能、改善血管性癡呆患者認(rèn)知功能等藥理作用，對(duì)阻止早期老年癡呆進(jìn)一步發(fā)展、維持殘存的腦功能、治療重癥肌無(wú)力等[6-12]而引起全世界科學(xué)家的共同關(guān)注，成為治療阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)最具前景的藥物[13-14]。由于眾多因素限制，石杉?jí)A甲及其類似物的獲得至今仍無(wú)法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)[15]。因此要解決藥源問(wèn)題，尋找新的途徑勢(shì)在必行。鑒于藥用植物內(nèi)生真菌具有的潛在重要的應(yīng)用價(jià)值，【本研究切入點(diǎn)】本研究從蛇足石杉內(nèi)分離獲得一株產(chǎn)生物堿的內(nèi)生真菌，【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為蛇足石杉生物堿的綜合利用開(kāi)辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植株 蛇足石杉：供試蛇足石杉[Huperziaserrata(Thunb.) Trev.]健康植株材料于2017年 5月由福建龍巖當(dāng)?shù)鼐用癫杉?/p>

1.1.2 主要試劑與儀器 石杉?jí)A甲對(duì)照品購(gòu)于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；引物(ITS1和ITS4)由生工生物工程上海股份有限公司合成；薄層色譜硅膠 GF254為青島海浪硅膠干燥劑廠制造；其他藥品為分析純。

恒溫?fù)u床(ZHNY-2112B)，中國(guó)天津歐諾公司；Eppendorf AG 5424CP755468高速離心機(jī)，德國(guó) Eppendorf 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (RE-2000)，上海亞榮生化儀器廠。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)，用于植株樣品內(nèi)生真菌的形態(tài)研究，培養(yǎng)基中加入 15 μg/mL 鏈霉素用于分離純化內(nèi)生真菌。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)，用于內(nèi)生真菌的搖床培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)、純培養(yǎng)和保存 本部分實(shí)驗(yàn)操作參考閔長(zhǎng)莉等[16]的方法并作了適當(dāng)?shù)母牧肌⒉杉男迈r蛇足石杉植株先用自來(lái)水浸泡和沖洗，然后在無(wú)菌室按照如下程序操作：整株蛇足石杉先用75 % 酒精進(jìn)行浸泡消毒 30 s，無(wú)菌水沖洗 4 次，接著用 10 % NaClO 浸泡 5 min，無(wú)菌水沖洗 4 次，最后再用75 %酒精浸泡消毒30 s，無(wú)菌水沖洗4 次，消毒完成后將根、莖、葉用滅菌鑷子和剪刀分開(kāi)，并用無(wú)菌刀片將根和莖切成0.5 cm 大小帶斜口的段，葉片切成0.3 cm × 0.3 cm 小塊，獲得組織塊共計(jì)100塊。將根和莖以斜口面垂直于平板斜插入一半到含 15 μg/mL鏈霉素的 PDA 平板上，葉片貼覆到含有 15 μg/mL鏈霉素的 PDA 平板表面，隨后倒置于 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)將末次消毒的最后一次沖洗組織塊的無(wú)菌水涂布在PDA平板表面同樣條件下進(jìn)行培養(yǎng)作為對(duì)照用以檢驗(yàn)消毒效果。2 d 后逐日觀察，無(wú)菌操作法挑取在根、莖斜面和葉片切口及與之接觸的培養(yǎng)基表面所長(zhǎng)出的菌絲，轉(zhuǎn)種到新鮮的 PDA 平板上，對(duì)于轉(zhuǎn)種生長(zhǎng)繁殖的真菌，挑取菌絲尖端部分再次轉(zhuǎn)種分離純化，直到獲得純化的內(nèi)生真菌為止。純化的內(nèi)生真菌菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)后放置于 4 ℃冰箱保藏待用。

1.2.2 內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)和發(fā)酵液粗提物的制備 將分離得到的蛇足石杉內(nèi)生真菌接種到PDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作菌株活化，待其長(zhǎng)滿斜面后將活化的菌株分別接種于裝有100 mL PDL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中(每個(gè)菌株接種3瓶)，置于搖床上，28 ℃，120 r/min 振蕩培養(yǎng)10 d。振蕩培養(yǎng)10 d 后，在三角瓶中加入100 mL乙酸乙酯，放置于搖床上120 r/min，12 h。之后分裝于離心管中，4000 r/min離心10 min，取上清，所得水相繼續(xù)用等體積的乙酸乙酯萃取2次。合并有機(jī)相，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，再用10 mL乙酸乙酯溶解，取出烘干，最后用 2 mL甲醇溶解，冷凍保存待用。

1.2.3 產(chǎn)石杉?jí)A甲內(nèi)生真菌的初步篩選 ①生物堿檢測(cè)。選用碘化鉍鉀試劑、碘化汞鉀試劑、碘-碘化鉀試劑和硅鎢酸試劑作為蛇足石杉內(nèi)生真菌發(fā)酵液生物堿的檢測(cè)試劑。取保存的發(fā)酵液粗提物0.5 mL于1.5 mL離心管中，共裝4管，分別加入3滴生物堿沉淀反應(yīng)試劑，靜置30～60 min后觀察結(jié)果。②產(chǎn)石杉?jí)A甲內(nèi)生真菌的篩選。薄層層析法參照 Zhang et al.[17]等方法進(jìn)行產(chǎn)石杉?jí)A甲內(nèi)生真菌的初步篩選。層析板采用GF254硅膠板，用毛細(xì)管將石杉?jí)A甲對(duì)照品溶液、待檢樣品溶液以及待撿樣品溶液和對(duì)照品溶液的混合液在硅膠板上分別點(diǎn)樣，然后置于層析缸中，展開(kāi)劑為丙酮∶氯仿∶異丙醇(4∶4∶2，體積比)溶液，在紫外線下照射顯示熒光。通過(guò)Rf值初步篩選產(chǎn)石杉?jí)A甲的菌株。設(shè)置不產(chǎn)生物堿內(nèi)生真菌發(fā)酵液和不接種內(nèi)生真菌的PDL作為對(duì)照組。

1.2.4 蛇足石杉內(nèi)生菌菌株的形態(tài)學(xué)研究和鑒定 采用點(diǎn)種法將蛇足石杉內(nèi)生真菌接種于 PDA平板上置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，依照真菌的經(jīng)典分類鑒定方法，進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。肉眼觀察內(nèi)生真菌菌落的的宏觀形態(tài)特征，包括菌落形狀、正反面顏色、菌落大小、邊緣特征、菌絲性狀、生長(zhǎng)速度和菌絲體等情況。用透明膠帶以菌落中心向邊緣的方向粘取菌落的表面菌絲，置于普通光學(xué)生物顯微鏡觀察孢子梗、孢子的有無(wú)、孢子形狀以及孢子顏色或其他產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等微觀特征。參考相關(guān)菌物分類學(xué)專著確定菌株的屬種[18-20]。

1.2.5 蛇足石杉內(nèi)生真菌的分子系統(tǒng)學(xué)研究 ①供試菌株基因組DNA的提取。將產(chǎn)生物堿內(nèi)生真菌種入PDA平板表面，在28 ℃條件下培養(yǎng)3～7 d后刮取菌絲放入滅菌的研缽中，再加入液氮充分研磨，最后用CTAB法提取基因組DNA。②PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增和測(cè)序所用的引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)與ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)(White et al，1990)，上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增體系(50 μl)：2×PowerTaqPCR MasterMix(25 μl)；Primer1(2 μl，0.2 μmol/L)；Primer2(2 μl，0.2 μmol/L)；DNA模板(2 μl)；ddH2O(19 μl)。擴(kuò)增條件：95 ℃ 預(yù)變性 3 min；35個(gè)循環(huán)：94 ℃ 變性 1 min，55 ℃ 復(fù)性 1 min，72 ℃ 延伸1 min 20 s；72 ℃ 延伸 10 min。用含G-Red的1.0 % 瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司青島分公司進(jìn)行產(chǎn)物純化和測(cè)序。 ③構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。將獲得的ITS序列與GenBank/EMBL/DDBJ核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)錄入的序列進(jìn)行BLAST search，并下載數(shù)據(jù)庫(kù)中近緣菌株的序列，用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。用Clustalx1.83進(jìn)行多序列比對(duì)(Alignment)，比對(duì)結(jié)果利用MEGA6.0軟件采用Maxium Likelihood統(tǒng)計(jì)學(xué)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值設(shè)置為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)生物堿內(nèi)生真菌的篩選

2.1.1 生物堿試劑沉淀法檢測(cè) 生物堿試劑的沉淀反應(yīng)結(jié)果分別為淡紅棕色沉淀、白色沉淀、淡褐色沉淀和白色沉淀。經(jīng)過(guò)篩選，獲得均產(chǎn)生沉淀的菌株1株，菌株編號(hào)為L(zhǎng)YS081(表1)。

2.1.2 薄層色譜法檢測(cè) 采用GF254硅膠板對(duì)內(nèi)生真菌 PDL 的發(fā)酵液粗提物進(jìn)行薄層層析(TLC)，再用疑似菌株進(jìn)行第二批次的發(fā)酵、萃取和薄層層析(圖1)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，菌株LYS081的發(fā)酵液粗提物呈現(xiàn)與 HupA 標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率(Rf值)非常接近，其Rf值均為0.5882，石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品Rf值為 0.6176。但和標(biāo)準(zhǔn)品混合后，在薄層層析結(jié)果圖上的斑點(diǎn)并沒(méi)有重合。

表1生物堿試劑與蛇足石杉內(nèi)生真菌發(fā)酵液沉淀反應(yīng)

Table 1 Precipitation reaction between alkaloid reagents and broth produced by endophytic fungi fromHuperziaserrata

MLYS02LYS081碘化汞鉀--+硅鎢酸--+碘-碘化鉀--+碘化鉍鉀--+

注：+：產(chǎn)生沉淀；-：不產(chǎn)生沉淀;M：PDB培養(yǎng)基提取物。

Note: +: Positive results; -: Negative results.

C：石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品；1：PDB培養(yǎng)基提取物；2、4：分別為菌株LYS02、LYS081培養(yǎng)濾液提取物；3：菌株LYS081培養(yǎng)濾液提取物與石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品混合物C: Standard HupA sample; 1: The extracts of potato dextrose medium; 2, 4: Metabolite of strain LYS02, LYS081; 3: The mixture of HupA and metabolite of strain LYS081圖1 蛇足石杉內(nèi)生菌PDB中發(fā)酵液提取物的TLCFig.1 TLC analysis of extracts of fermentation by Huperzia serrata endophytic fungi in PDB

2.2 蛇足石杉內(nèi)生菌菌株的形態(tài)學(xué)特征和鑒定

菌株LYS081在PDA平板上經(jīng)28 ℃的恒溫暗培養(yǎng)，4 d 后菌落直徑85 mm，生長(zhǎng)速度快。菌落正面白色，絮狀菌絲，菌落中心氣生菌絲有逐漸消失趨勢(shì)，背面米黃色(圖2A、B)。菌絲有隔，色淺，寬4～10 μm(圖2C)。分生孢子梗單生(圖2D、F)，有分枝(圖2D)，長(zhǎng)約20～30 μm，瓶梗單個(gè)或簇生，在瓶梗頂端產(chǎn)生瓶梗孢子(圖2D、E)，瓶梗孢子聚集成頭部(圖2E、F)，瓶梗孢子單細(xì)胞，圓形或卵圓形，色淺，透明或半透明，瓶梗孢子大小為3～5 μm。經(jīng)查閱相關(guān)菌物學(xué)專著文獻(xiàn)[18-20]，發(fā)現(xiàn)以上特征符合木霉屬(Trichoderma)真菌的形態(tài)特征，形態(tài)學(xué)確定隸屬于木霉屬(Trichoderma)。

2.3 基于ITS 序列的分子系統(tǒng)學(xué)分析

將獲得的ITS序列與GenBank/EMBL/DDBJ核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)錄入的序列進(jìn)行BLAST search，并下載數(shù)據(jù)庫(kù)中近緣菌株的序列，同時(shí)將該序列錄入核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)(accession number)MH321525.1，該序列和下載序列一并用于構(gòu)建基于rDNA ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。

菌株LYS081在系統(tǒng)樹(shù)上與康寧木霉[Trichodermakoningiopsis(KY568699.1)]聚在一起，支持率86 %，他們之間的相似性很高，達(dá)到了99 %，說(shuō)明有著很高的同源性，在發(fā)育關(guān)系上有著很近的距離。LYS081和參考株康寧木霉[Trichodermakoningiopsis(KY568699.1)]的遺傳距離有0.0248，大于0.01，存在較大的分歧。綜合系統(tǒng)發(fā)育分析和序列遺傳距離數(shù)據(jù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，菌株LYS081隸屬于木霉屬(Trichoderma)，較難鑒定到種，明確界定種屬需要進(jìn)一步的分析和研究。

A、B：在PDA平板上28 ℃培養(yǎng)形成色白色菌落，85 mm/4d，A正面，B反面；C：菌絲，菌絲有隔；D、E和F：產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，分生孢子梗單生，有分枝，瓶梗簇生，分生孢子聚集黏連成頭部；G：分生孢子，單細(xì)胞，圓形或卵圓形。A、B標(biāo)尺為20 mm；C、D、E、F、G為10 μmA and B: Forming white colony on PDA culture medium at 28 ℃ for 4 days, A: The obverse side, B: The reverse side; C: Hypha,septate hypha; D,E and F: Spore-formed structure; G: Conidia. Bars: A and B=20 mm; C, D, E, F and G=10 μm圖2 蛇足石杉內(nèi)生真菌LYS081的菌落、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子形態(tài)Fig.2 Morphological characters of strain LYS081

菌株名或種名后的括號(hào)為序列的登錄號(hào)；系統(tǒng)樹(shù)內(nèi)節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字表示bootstrap檢驗(yàn)值；標(biāo)尺刻度代表序列差異The accession number is shown in parenthesis; Numbers at the branch points indicated the value of bootstrap test support based on 1000 sets; The scale bar means sequence difference圖3 LYS081基于rDNA ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 LYS081 phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence

3 討 論

植物內(nèi)生真菌與宿主在長(zhǎng)期互作用中逐漸演化形成了一種互惠共生的關(guān)系，可產(chǎn)生與植株相似，甚至相同的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，開(kāi)發(fā)和利用內(nèi)生真菌產(chǎn)具有生物學(xué)活性的物質(zhì)成為目前國(guó)內(nèi)外研究的新領(lǐng)域和熱點(diǎn)。木霉屬(Trichoderma)真菌菌屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)叢梗孢目(Moniliales)叢梗孢科(Moniliaceae)，廣泛存在于自然界。Weindling[21](1932年)研究發(fā)現(xiàn)木霉屬真菌有著對(duì)植物病原真菌的拮抗作用，開(kāi)發(fā)和利用木霉菌進(jìn)行生防有了較大進(jìn)展。據(jù)報(bào)道，木霉屬真菌對(duì)Rhizoctoniasolani、Fusariumspp、Sclerotiumrolfsii和Phythiumspp.等植物病原菌具有拮抗作用[22-23]；魏洪璇等[24]報(bào)道哈茨木霉(Trichodermaharzianum)發(fā)酵液具有廣譜抗菌活性和抗腫瘤活性。

生物堿是一類廣泛存在于生物界重要的天然化合物，有著顯著的生物學(xué)活性?，F(xiàn)有報(bào)道表明，植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生數(shù)十種生物堿，這些生物堿具有拮抗病原菌、拮抗線蟲(chóng)等多種生物學(xué)活性。隨著1993年，Strobel 等[2]從短葉紫杉(Taxusbrevifolia) 中分離獲得一株能產(chǎn)生紫杉醇(抗癌)的安德氏紫杉霉(Taxomycesandreanae)內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生和宿主植物相同或相似的活性物質(zhì)。如，抗腫瘤藥物喜樹(shù)堿[25]、抗菌和抗腫瘤活性的吲哚二酮哌嗪類生物堿[26]、收縮血管效用的麥角類生物堿[27]、乙酰膽堿酯酶高抑制活性的石杉?jí)A甲[28]等。本研究中，對(duì)分離獲得的蛇足石杉內(nèi)生真菌進(jìn)行生物堿和疑似產(chǎn)石杉?jí)A甲的菌株進(jìn)行初步篩選，發(fā)現(xiàn)菌株LYS081能合成生物堿。該菌株產(chǎn)生的生物堿是什么，有什么樣結(jié)構(gòu)，有無(wú)乙酰膽堿酯酶抑制活性、或有無(wú)拮抗植物病原菌活性、或有無(wú)抗腫瘤活性，活性機(jī)制是什么，其產(chǎn)量如何，遺傳穩(wěn)定性如何，都值得進(jìn)一步研究，這將為利用內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)乙酰膽堿酯酶抑制性物質(zhì)提供新的菌種支持。