王 立，王有國，崔光芬，王祥寧，馬璐琳，段 青，杜文文，賈文杰*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】百合是享譽世界的著名球根花卉，擁有“球根花卉之王”的美譽，觀賞性極佳，隨著中國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們對于百合鮮切花的需求也在日益劇增[1]。歐美國家自 20 世紀(jì)初即開展了百合育種工作，選育了大量優(yōu)良的雜種系，其中東方百合雜種系是世界，也是中國最為流行的切花運用雜種系[2]。但是由于其花粉量大，往往在運用時容易污染衣物和環(huán)境，因此，培育雄性不育的無花粉百合一直是百合育種的重點方向[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】如何開發(fā)相關(guān)分子標(biāo)記技術(shù)來輔助實現(xiàn)無花粉百合的育種，是該項育種工作中的核心。目前利用分子標(biāo)記進(jìn)行的百合研究，主要集中在分析瀘定百合[4]、淡黃花百合[5]等不同群體的遺傳多樣性與親緣關(guān)系方面，運用的是常用的分子標(biāo)記技術(shù)，主要有RAPD、ISSR、AFLP、SRAP[6]，也有基于EST序列開發(fā)百合SSR分子標(biāo)記的研究[7]，而基于東方百合雄性不育系轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果開發(fā)SSR分子標(biāo)記，并利用SSR標(biāo)記進(jìn)行無花粉百合遺傳多樣性分析的研究鮮有報道?！颈狙芯康那腥朦c】本研究在雄性不育東方百合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基礎(chǔ)上，開發(fā)SSR分子標(biāo)記，并驗證其有效性。【擬解決的關(guān)鍵問題】為實現(xiàn)利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行輔助無花粉百合的育種和品種指紋圖譜構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于云南省農(nóng)科院花卉所球根中心百合課題組2015年對東方百合高通量測序的結(jié)果。測序所用材料：東方百合可育系及其變異不育系造孢細(xì)胞期和四分體期花藥，每個時期取6朵花花藥[3]。分別提取2個時期的花藥RNA，測序時將2個時期的RNA分別等量混合后構(gòu)建文庫，每個時期構(gòu)建2個文庫。委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司對提取的RNA完成RNA-Seq測序，并通過Trinity方法組裝[8]。共得到135 483條Unigenes作為背景數(shù)據(jù)。

1.2 實驗材料及DNA提取

SSR分子標(biāo)記可用性實驗材料為東方百合有花粉品種和云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的東方百合無花粉品系，采樣共計24份，每個株系取4～5片新鮮葉片，用變色硅膠干燥，室溫保存直到DNA提取。

總DNA的提取采用改良的CTAB法進(jìn)行[4]，針對百合多糖較多，增加去蛋白質(zhì)、多糖的步驟。選取DNA條帶清晰，亮度與Marker相當(dāng)?shù)挠脕砗Y選SSR引物。DNA母液稀釋后放入-20 ℃冰箱保存。

1.3 轉(zhuǎn)錄組 SSR 位點鑒別及 SSR引物設(shè)計

用Trinity軟件將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝，獲得轉(zhuǎn)錄本序列。組裝共得到222 365條Transcript和135 483條Unigene。采用MISA(1.0版，默認(rèn)參數(shù)。)按照各個unit size的最少重復(fù)次數(shù)標(biāo)準(zhǔn)1-10，2-6，3-5，4-5，5-5，6-5對Unigene進(jìn)行SSR檢測，詳見 http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html。找出SSR標(biāo)記之后，采用Primer3(2.3.5版，默認(rèn)參數(shù))進(jìn)行SSR引物設(shè)計[9]。

1.4 SSR引物篩選

SSR引物由精賽頓生物科技有限公司(云南)合成，從轉(zhuǎn)錄組SSR數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)選取71對引物，其中包括各核苷酸重復(fù)類型。從供試百合材料中隨機(jī)挑選 24個個體對71對 SSR引物進(jìn)行初步篩選(表1)。PCR擴(kuò)增體系為10 μl：10×Buffer(Mg2+)1 μl；dNTP10 mmol/L 0.8 μl；上下游引物各 0.5 μl；Taq酶0.05 μl；DNA模板 0.5 μl，ddH2O 6.65 μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性30 s、53 ℃(各引物有所不同)退火30 s 、72 ℃延伸30 s，反應(yīng)34個循環(huán)，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。然后將PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行多態(tài)性初篩，為了進(jìn)一步確定引物的多態(tài)性，對能擴(kuò)增出條帶的引物再進(jìn)行2 %瓊脂糖凝膠電泳，采用花青素的方法顯色，以得到條帶多且亮的引物。

表1 供試百合材料

表2 百合轉(zhuǎn)錄組中不同SSR類型的數(shù)量以及頻率

注：c&c*均為復(fù)雜重復(fù)。

Note: c&c* are complex repeats.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用SSR的出現(xiàn)頻率和SSR的平均分布距離來描述SSR。計算公式分別為SSR的出現(xiàn)頻率：fc(%)=c/n×100，其中n為無冗余EST數(shù)量，c為搜索到的SSR數(shù)量；SSR的平均分布距離：fN=N/c，其中，N為無冗余EST數(shù)量的總堿基數(shù)，c為搜索到的SSR數(shù)量。對瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的處理方法：采用人工讀帶的方式，在相同遷移的位置上，無帶的記為0，有帶的記為1，缺失的記為9，進(jìn)行統(tǒng)計擴(kuò)增結(jié)果，通過參考 Smith等[6]的方法計算多態(tài)信息含量(PIC)值。應(yīng)用 POPGENE Version 1.31軟件對標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳參數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合轉(zhuǎn)錄組中SSR 的分布及結(jié)構(gòu)特點

轉(zhuǎn)錄組測序共獲得135 483條Unigenes，利用 MISA 軟件對獲得的Unigenes做SSR分析，發(fā)現(xiàn)其中11 649條Unigenes序列中包含有12 391個SSR位點，其中包含2個或2個以上SSR位點的序列有742條，占6.4 %。SSR的類型十分豐富，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型共11 948個，同時還存在復(fù)雜重復(fù)類型443個。

單核苷酸所占比例最大，為 63.94 %；其次是二核苷酸、三核苷酸分別占總 SSR 的 20.65 %和 11.21 %；四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)類型比較少，分別占 0.46 %、0.10 %、0.06 %，復(fù)雜重復(fù)類型占3.58 %。轉(zhuǎn)錄組 SSR 重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布在 5～24次，單核苷酸重復(fù)單元主要在10次和10次以上，分別占總SSR的 26.10 %和37.84 %；二核苷酸至六核苷酸重復(fù)單元中，5次、6次重復(fù)所占比例最大，分別占7.66 %和9.13 %；通過分析，發(fā)現(xiàn)二核苷酸重復(fù)的次數(shù)主要在6、7、8 次；而三核苷酸的重復(fù)次數(shù)主要在 5、6、7 次。如表2所示。

2.2 轉(zhuǎn)錄組 SSR重復(fù)類型和頻率特征

百合轉(zhuǎn)錄組的SSR核苷酸基序類型十分豐富，其中以單核苷酸重復(fù)類型為主，單核苷酸主要重復(fù)次數(shù)為10次和10次以上，以A和T為主。A單核苷酸重復(fù)占4種單核苷酸重復(fù)的51.1 %，T單核苷酸重復(fù)占45.6 %，G單核苷酸重復(fù)占2.3 %，C單核苷酸重復(fù)占1.0 %，各單核苷酸詳細(xì)重復(fù)情況見圖1。

圖中縱坐標(biāo)軸為同類核苷酸某一重復(fù)次數(shù)所占百分比The vertical axis in the figure means the percentage of a repetition of the same nucleotide圖1 單核苷酸重復(fù)類型分析Fig.1 The types of mononucleotide repetition

二核苷酸主要以 AT/AT、TA/TA、AG/CT、CT/AG、GA/TC、TC/GA為主，其中，GA/TC所占比例最大，達(dá)到 4.70 %，AT/AT占2.59 %，AG/CT 占 3.28 %；三核苷酸重復(fù)的主要類型較二核苷酸的類型多，以 GGC/GCC、GAG/CTC、GGA/TCC為主，GGC/GCC占0.68 %，其次是GAG/CTC占0.65 %；四、五核苷酸基序類型較二、三核苷酸基序類型少，TAAA/TTTA、CCCA/TGGG、GTCCG/CGGAC是最主要的幾個類型，但所占比重低。詳細(xì)SSR重復(fù)信息如表 3所示。

表3 SSR中二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元類型的數(shù)量及頻率

續(xù)表3 Continued table 3

重復(fù)單元類型Repeat motifsSSR重復(fù)基元類型的數(shù)量(個)The number of SSR repeat motifs5次重復(fù)6次重復(fù)7次重復(fù)8次重復(fù)9次重復(fù)10次重復(fù)>10次重復(fù)合計頻率(%)FrequencyCTC/GAG251451000450.36TG/CAG13210000160.13CTT/AAG14710000220.18GAA/TTC11820000210.17GAC/GTC410100060.05GAG/CTC522260000800.65GAT/ATC13110000150.12GCA/TGC15410000200.16GCC/GGC37691000530.43GCG/CGC251481000480.39GCT/AGC10421000170.14GGA/TCC481561000700.56GGC/GCC5517120000840.68GGT/ACC281130000420.34GTC/GAC410000050.04GTG/CAC13550000230.19GTT/AAC100000010.01TAA/TTA9661000220.18TAC/GTA010000010.01TAG/CTA100000010.01TAT/ATA24840000360.29TCA/TGA800000080.06TCC/GGA 21 221000260.21TCG/CGA 5 10000060.05TCT/AGA 13 021000160.13TGA/TCA 14 700000210.17TGC/GCA 12 320000170.14TGG/CCA 20 1031000340.27TTA/TAA 24 1090000430.35TTC/GAA 15 101000170.14TTG/CAA 4 20000060.05總計 8891123662382359393140394831.86百分比(%)7.179.065.343.082.903.171.1331.86

2.3 SSR引物的有效性驗證

隨機(jī)選取71對引物，其中包括單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸等6種重復(fù)基元的SSR位點進(jìn)行引物有效性驗證。以東方百合材料的24個樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選。其中22對引物能擴(kuò)增出比較理想的產(chǎn)物，有效率為30.99 %。這說明利用東方百合花藥EST序列開發(fā)的SSR引物是高效可行的。圖2為部分引物在24份東方百合樣品中擴(kuò)增的情況。

2.4 SSR引物評價

在71對隨機(jī)選取的SSR引物中，22對能夠成功擴(kuò)增出條帶，有效率為30.99 %。利用驗證的22對引物對24份東方百合材料進(jìn)行擴(kuò)增及多態(tài)性的評價，22對SSR引物在東方百合中表現(xiàn)出多態(tài)性，共獲得了108個等位基因，分子標(biāo)記中等位基因最多為10，最少為3，平均等位基因數(shù)5個，其中93017，191987，201703和 960002 4個引物的等位基因數(shù)分別是10，8，7，5個。觀望雜合度的范圍介于0.0154～0.4514，均值0.1977，期望雜合度的范圍介于0.1547～0.8471，均值0.4533。22個位點的PIC值變化范圍在0.1254～0.9248，平均值在0.5048，其中，高度多態(tài)的SSR分子標(biāo)記有11對(PIC≥0.5)，表4為22對引物的多態(tài)性擴(kuò)增情況。

圖2 部分SSR引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of some SSR primers

表4 百合22個SSRs 標(biāo)記的特征

續(xù)表4 Continued table 4

引物編號Primer No.SSR 基序重復(fù)Repeat motif上、下游引物序列Primer sequence 5’-3’Tm(℃)等位基因數(shù)Na觀測雜合度Ho期望雜合度He多態(tài)信息含量PIC203915(CACTGC)13F:TGCCAACATTCTCCGCAGATR:GTGTTGGCAAAGGCAGTGTT6050.42580.33250.5149202350(CCTGCC)8F:GAAAGACCCCTGGGACATGGR:AGACAAGCTCGGGGTTCTTG6040.45140.58140.3269188282(CCGAGC)5F:CCCAAAATGCCCTTCCTCCTR:TGTTTCGAGGGAGTGAACGG6040.21560.21440.3547206853(GGGTG)5F:AGGTGTTCGAGCTTGGGTTCR:AGATTCTCTCAAACGCGGCA6040.15420.36540.1254220620(GTCCG)5F:ACCTAACGGAGCAATGCACAR:GCAAAGCCTGGACGAGTTTC6050.01980.21590.6559203915(CACTGC)13F:TGCCAACATTCTCCGCAGATR:GAGTGTTGGCAAAGGCAGTG6040.24870.44580.4225202620(GTCCG)5F:ACCTAACGGAGCAATGCACAR:GACGGGACAAGCGGACTTAT6050.03650.15470.5874193722(GGGAG)5F:AGGGAAAGGACAGGCTCTCAR:AGTCCTGCGGTGAAGGAAAT6040.24780.32650.2164平均值///50.19770.45330.5048

3 討 論

隨著高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，通過轉(zhuǎn)錄組測序來開發(fā)EST-SSR引物的成本大為降低，對于類似百合這樣由于基因組巨大而缺乏基因組信息的物種，該技術(shù)提供了前所未有的機(jī)遇，已在許多植物中得到了廣泛的應(yīng)用，如榧樹[10]，云南松[11]，西紅花[12]，印度南瓜[13]，南方紅豆杉[14]，燈盞花[15]等。大量研究工作表明，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以挖掘和開發(fā)出豐富的SSR 標(biāo)記[16]。

本研究對東方百合可育系及其變異雄性不育系2個不同發(fā)育時期的百合花藥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共組裝得到222 365條Transcript和135 483條Unigene。利用MISA程序?qū)Y選得到的1 Kb 以上的Unigene做SSR位點搜索，共獲得12 391個SSR位點。SSR位點發(fā)生頻率為9.14 %，高于菊芋(8.64 %)[17]、魚腥草(7.51 %)[18]、云南松(3.07 %)[11]等植物，低于西紅花(18.73 %)[12]。表明東方百合雄性不育系轉(zhuǎn)錄組中SSR數(shù)量相當(dāng)豐富。

通過對基于東方百合雄性不育系轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR重復(fù)基元分析發(fā)現(xiàn)，該SSR分子標(biāo)記的重復(fù)基元種類繁多，有單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸以及復(fù)雜重復(fù)基元等。而重復(fù)基元主要集中在單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)，其中以單核苷酸重復(fù)最多，這與榧樹[18]的SSR分布類型極為相似、而與印度南瓜[13]、菊芋[17]、云南松[11]等植物多以二核苷酸、三核苷酸重復(fù)類型為主的SSR分布類型有所不同，說明東方百合SSR重復(fù)基元與其他物種的情況存在相似性，同時也存在一定的差異性。與杜方[19]等研究者基于百合不同器官EST開發(fā)的SSR多以二核苷酸和三核苷酸重復(fù)為主也有所不同，說明基于同一種植物不同器官組織轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果開發(fā)的SSR分布類型也有所不同。22對可擴(kuò)增產(chǎn)物的SSR引物中，各對SSR等位基因多，多態(tài)信息含量PIC值高，說明SSR引物表現(xiàn)穩(wěn)定可重復(fù)的多態(tài)性。

4 結(jié) 論

本研究成功篩選出22 對多態(tài)性較高、條帶清晰、穩(wěn)定性好的引物。隨機(jī)對24種不同來源的東方百合可育品種及雄性不育系初篩的引物進(jìn)行多態(tài)性驗證分析，結(jié)果顯示在22對SSR引物中，引物表現(xiàn)穩(wěn)定可重復(fù)的多態(tài)性，各個位點的等位基因介于3～8個，平均等位基因數(shù)5個，多態(tài)信息含量PIC、觀測雜合度Ho、期望雜合度He的平均值分別是0.5048，0.1977和0.4533。研究表明通過對東方百合雄性不育系轉(zhuǎn)錄組分析可獲得較高頻率的SSR位點且類型豐富。將為東方百合雄性不育分子標(biāo)記輔助育種和功能基因的挖掘等奠定基礎(chǔ)，同時對東方百合分子標(biāo)記類型、遺傳資源評價、繪制遺傳圖譜、實現(xiàn)特定性狀的輔助選擇和進(jìn)行比較基因組學(xué)研究也有重要意義。