楊方慧，夏麗飛，蔣會(huì)兵，孫云南，田易萍，梁名志，陳林波*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/云南省茶樹(shù)種質(zhì)資源創(chuàng)新與配套栽培技術(shù)工程研究中心，云南 勐海 666201；2.云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 勐海 666201)

【研究意義】茶樹(shù)(Camelliasinensis)是一種重要葉用經(jīng)濟(jì)作物，是多年生的異花授粉植物。茶樹(shù)花屬完全花，兩性花，由花托、花萼、花冠、雄蕊群和雌蕊組成，是茶樹(shù)繁育后代的重要器官，花器官的正常發(fā)育是茶樹(shù)賴以繁衍的基礎(chǔ)[1]。然而，作為葉用作物的茶樹(shù)，開(kāi)花結(jié)果會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。因此，開(kāi)展茶樹(shù)花發(fā)育的相關(guān)研究具有重要的理論意義和實(shí)踐意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生長(zhǎng)素(即吲哚-3乙酸，indole-3-acetic acid, IAA)是調(diào)控植物諸多生物過(guò)程的重要內(nèi)源激素，參與植物生殖發(fā)育的多個(gè)過(guò)程，包括雄蕊形成，花絲延伸，花粉發(fā)育及花藥開(kāi)裂等[2-3]。生長(zhǎng)素在植物中的生物學(xué)功能主要通過(guò)其合成、運(yùn)輸及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)3個(gè)過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)，損害或抑制任何一個(gè)過(guò)程都會(huì)影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)環(huán)境適應(yīng)性的響應(yīng)[4-5]。YUCCA基因家族是一類編碼類黃素單加氧酶(flavin monooxygenase-like enzyme, FMO)基因，可催化吲哚丙酮酸直接轉(zhuǎn)變成IAA，是色氨酸依賴的吲哚乙酸生物合成途徑中的一個(gè)限速酶，在維持生長(zhǎng)素含量方面起著關(guān)鍵作用[6-8]。目前，YUCCA同源基因已在多種植物中得到克隆，如草莓[9]、煙草[10]、擬南芥[2]和水稻[11]等，其中擬南芥中有11個(gè)YUCCA基因[2]，水稻基因組中鑒定出7個(gè)類YUCCA基因[11]。【本研究切入點(diǎn)】本研究基于前期挖掘茶樹(shù)花不育相關(guān)基因時(shí)[12]，篩選出一條與YUCCA10基因高度同源的基因序列，通過(guò)對(duì)‘云茶1號(hào)’的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)查找[13]，獲得含有完整編碼的YUCCA10基因CDS序列，再對(duì)其序列進(jìn)行克隆驗(yàn)證，并對(duì)YUCCA10基因的基本生物信息學(xué)特征進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探究YUCCA10基因在正?；ê筒挥ㄖ械谋磉_(dá)規(guī)律，為深入探索YUCCA10基因和生長(zhǎng)素合成對(duì)茶樹(shù)花器官發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)源于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)基地的正常茶樹(shù)‘云抗10號(hào)’(目前利用該材料作為父本、母本均能獲得子代)以及不育茶樹(shù)，該不育茶樹(shù)為利用‘佛香2號(hào)’與‘福鼎大白茶’雜交獲得的一株不育花(參見(jiàn)文獻(xiàn)[12,14])的花芽、花蕾、含苞待放花以及取正常茶樹(shù)‘云抗10號(hào)’的芽、葉、莖、幼果、花瓣、雄蕊、雌蕊和不育花花瓣、雄蕊、雌蕊作實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

利用Trizol提取試劑盒，分別提取上述各樣品的總RNA，通過(guò)跑1 %的瓊脂糖凝膠電泳方法分析RNA的完整性以及是否有污染，利用Nanodrop檢測(cè)RNA的濃度，將檢測(cè)合格的總RNA樣品利用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA用于基因驗(yàn)證，利用RevertAid Premium Reverse Transcriptase合成試劑盒合成cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

1.3 CsYUCCA10基因CDS片段驗(yàn)證

根據(jù)查找獲得的CsYUCCA10基因CDS序列設(shè)計(jì)4對(duì)特異引物(表1)進(jìn)行CsYUCCA10基因的擴(kuò)增驗(yàn)證，通過(guò)跑膠回收后，將純化后的基因送到上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.4 CsYUCCA10基因序列的生物信息學(xué)分析

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站進(jìn)行BlastX比對(duì)分析；應(yīng)用BioXM2.6軟件進(jìn)行氨基酸組成分析、多重序列比較和同源性分析；利用工具ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/)在線分析蛋白的等電點(diǎn)和分子量；運(yùn)用軟件SOPMA預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 CsYUCCA10基因的qRT-PCR分析

以GAPDH基因(GE651107.1)為內(nèi)參，利用驗(yàn)證后的CsYUCCA10基因序列，按照熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物(表1)。參照BBI的SG Fast qPCR aster Mix定量PCR試劑和利用德國(guó)LightCycler 480進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min后；采用變性溫度95 ℃ 7 s，退火溫度57 ℃ 10 s，延伸溫度72 ℃ 15 s，45個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸15 s。設(shè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3個(gè)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 CsYUCCA10基因CDS驗(yàn)證和序列分析

在前期利用數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)篩選茶樹(shù)不育基因時(shí)[12]，獲得一條與吲哚-3丙酮酸氧化酶(YUCCA10)基因高度同源的基因，該基因在‘福鼎大白茶’(父本花)和‘佛香2號(hào)’(母本花)中上調(diào)表達(dá)，在其雜交后代不育花中為下調(diào)表達(dá)。為了獲得該基因完整編碼序列，從‘云茶1號(hào)’全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中查找到一條序列為1697 bp的CDS[13]，通過(guò)NCBI中Blastx比對(duì)顯示它具有YUCCA10完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)。為了驗(yàn)證其全長(zhǎng)，CDS設(shè)計(jì)4對(duì)特征引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)高保真酶擴(kuò)增(圖1)，分別將4對(duì)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物回收測(cè)序拼接后，獲得含有1137 bp的ORF(圖2)，編碼379個(gè)氨基酸，命名為CsYUCCA10。

1：特征引物YUCCA-1F和YUCCA-1R擴(kuò)增產(chǎn)物；2：特征引物YUCCA-2F和YUCCA-2R擴(kuò)增產(chǎn)物；3：特征引物YUCCA-3F和YUCCA-3R擴(kuò)增產(chǎn)物；M：DL 10 000 marker；4：特征引物YUCCA-4F和YUCCA-4R擴(kuò)增產(chǎn)物1: Amplification product of characteristic primers YUCCA-1F and YUCCA-1R; 2: Amplification product of characteristic primers YUCCA-2F and YUCCA-2R; 3: Amplification product of characteristic primers YUCCA-3F和YUCCA-3R; M: DL 10 000 marker; 4: Amplification product of characteristic primers YUCCA-4F and YUCCA-4R圖1 CsYUCCA10基因CDS擴(kuò)增驗(yàn)證Fig.1 CDS amplification verification of CsYUCCA10 genes

2.2 CsYUCCA10基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI在線分析，該蛋白含有保守功能結(jié)構(gòu)位點(diǎn)CzcO，屬于 Pyr_redox_2超級(jí)家族(圖3)，利用在線工具ExPASy預(yù)測(cè)其理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為42.63 kDa，等電點(diǎn)8.88，說(shuō)明該蛋白為堿性蛋白質(zhì)。利用在線工具SOPMA預(yù)測(cè)CsYUCCA10蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，含有α螺旋31.66 %，延伸鏈18.21 %，無(wú)規(guī)則卷曲42.48 %，β折疊7.65 %。

圖2 CsYUCCA10 CDS與推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 CDS sequences of CsYUCCA10 and their deduced amino acids

圖3 CsYUCCA10蛋白功能性位點(diǎn)分析Fig.3 Functional site analysis of CsYUCCA10 protein

通過(guò)CsYUCCA10的氨基酸同源序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與獼猴桃(Actinidiachinensisvar. Chinensis，登錄號(hào)為PSR86028.1)相似性為81 %，與橄欖(Oleaeuropaeavar. Sylvestris，登錄號(hào)為XP_022869081.1)的相似性為71 %，與葡萄(Vitisvinifera，登錄號(hào)為XP_002269763.1)和蓮(Nelumbonucifera，登錄號(hào)為 XP_010245350.1)相似性為73 %。在擬南芥YUC基因家族蛋白中均含有黃素單加氧酶共有的還原型輔酶Ⅱ結(jié)合位點(diǎn)(NADPH-binding site)和FAD結(jié)合位點(diǎn)(FAD-binding site)[15]。分析發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)CsYUCCA10基因中的FAD-binding site序列為GAGPSG，NADPH-binding site序列為GSGNSG(圖4)，這2個(gè)位點(diǎn)保守域中甘氨酸殘基對(duì)于輔因子結(jié)合和黃素單加氧酶活性是必須的。茶樹(shù)CsYUCCA10具有保守甘氨酸殘基，說(shuō)明茶樹(shù)CsYUCCA10具有其功能。

2.3 茶樹(shù)CsYUCCA10基因的表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析茶樹(shù)CsYUCCA10基因在正?；ê筒挥ú煌l(fā)育期中的表達(dá)特征發(fā)現(xiàn)(圖5)，在正?；ㄖ须S著花的生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)量增加，花蕾為花芽的5.07倍，到含苞待放時(shí)表達(dá)最高，為花芽的6.1倍；然而在子代不育花中隨著花的發(fā)育，表達(dá)呈減少趨勢(shì)，花蕾期下降為花芽期的0.44倍，含苞待放期下降為花芽期的0.26倍；CsYUCCA10在正?；ǖ幕ò辍⑿廴?、雌蕊均顯著高于不育花(圖6)，在不育花中的表達(dá)量分別為正?；ɑò?、雄蕊、雌蕊的0.13、0.04和0.07倍。這些結(jié)果說(shuō)明了吲哚-3丙酮酸氧化酶基因在不育花中不能正常表達(dá)，均低于正?；ǎ茰y(cè)不育花中生長(zhǎng)素不能正常合成，影響了花的發(fā)育導(dǎo)致不育。同時(shí)還分析了CsYUCCA10在正常茶樹(shù)不同組織中的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)在葉片和莖中表達(dá)量最高，在果中表達(dá)量最低，是葉的0.08倍(圖7)，說(shuō)明CsYUCCA10的表達(dá)具有組織特異性。

方框A：FAD位點(diǎn)；方框B：NADPH位點(diǎn)Box A: FAD-binding site; Box B: NADPH-binding site圖4 CsYUCCA10與其他YUCCA10基因的氨基酸比對(duì)Fig.4 Comparison of amino acid sequences of CsYUCCA10 with other reported YUCCA10 proteins

圖5 CsYUCCA10在花不同發(fā)育期的表達(dá)特征Fig.5 The expressions of CsYUCCA10 in flowers of different development terms

圖6 CsYUCCA10在花不同組織中的表達(dá)特征Fig.6 The expressions of CsYUCCA10 in flowers of different tissues

3 討 論

花是被子植物的繁殖器官，花的發(fā)育是植物繁衍后代的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，受到多種因素的調(diào)控。對(duì)生長(zhǎng)素的生物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及極性運(yùn)輸相關(guān)突變體的研究表明，生長(zhǎng)素在花器官的形成和發(fā)育中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[16-17]。植物中生長(zhǎng)素的合成主要包括依賴色氨酸(Trp-dependent pathway)途徑和非依賴色氨酸(Trp-independent pathway)途徑，其中依賴于色氨酸的生長(zhǎng)素合成途徑是植物中主要的途徑[15,18]。YUCs是依賴于色氨酸生長(zhǎng)素合成途徑中的關(guān)鍵基因，證明YUC基因家族在生長(zhǎng)素的生物合成以及植物發(fā)育過(guò)程的作用證據(jù)來(lái)自于對(duì)擬南芥的yuc缺失突變體的研究。如擬南芥yuc2yuc6雙突變體，其表現(xiàn)為雄蕊發(fā)育缺陷，而yuc1yuc4雙突變體表現(xiàn)為花器官發(fā)育受阻，且沒(méi)有完整的花器官，全部敗育[2,19]。

圖7 CsYUCCA10組織特異性表達(dá)模式Fig.7 The tissue specific expression pattern of CsYUCCA10

本研究利用全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，驗(yàn)證克隆了1個(gè)含有完整編碼的茶樹(shù)YUCCA10基因，該基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?137 bp，編碼378個(gè)氨基酸，與其他植物的YUCCA10具有較高的相似性，并且含有FAD和NADPH位點(diǎn)以及與輔因子結(jié)合和黃素單加氧酶活性結(jié)合所必須的甘氨酸殘基，說(shuō)明茶樹(shù)YUCCA10在生長(zhǎng)素合成途徑中發(fā)揮其功能。采用qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)茶樹(shù)YUCCA10基因在正常茶樹(shù)花和不育花中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明，YUCCA10基因表達(dá)量在正?；ǖ幕ò?、雄蕊、雌蕊中要顯著高于不育花；在不同發(fā)育期，正常花中隨著花的生長(zhǎng)發(fā)育其表達(dá)量呈增加趨勢(shì)，而不育花呈現(xiàn)減少趨勢(shì)且顯著低于正常花；茶樹(shù)YUCCA10基因的表達(dá)還具有組織特異性。擬南芥中有YUCCA基因家族成員11個(gè)，都被證明參與了生長(zhǎng)素的生物合成過(guò)程，其表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，在時(shí)間和空間上調(diào)節(jié)模式有明顯的不同來(lái)控制生長(zhǎng)素合成的時(shí)空分布[2-3,7]。小麥的YUCCA10在生殖器官如花和種子中強(qiáng)烈表達(dá)，導(dǎo)入擬南芥有植株高大、莖稈粗壯的特點(diǎn)，存在部分植株敗育，后期花器官變形、花的結(jié)構(gòu)減少以及不能產(chǎn)生花粉，說(shuō)明小麥YUCCA10對(duì)花器官和種子的形成起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[20]。在擬南芥中YUCCA10參與胚胎發(fā)育與葉片形成[2,21]。因此，推測(cè)茶樹(shù)YUCCA10可能參與花器官形成和葉片發(fā)育。

生長(zhǎng)素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)主要依賴于生長(zhǎng)素的合成、極性運(yùn)輸能使生長(zhǎng)素積累在植物體某些特定部位，從而形成生長(zhǎng)素濃度梯度，植物再對(duì)生長(zhǎng)素信號(hào)的識(shí)別、下游生長(zhǎng)素相關(guān)基因的表達(dá)，最終表現(xiàn)出生理反應(yīng)[22-23]。項(xiàng)目組前期分析不育花和正?；ㄖ邪被峤M分時(shí)，發(fā)現(xiàn)不育花中的色氨酸明顯高于正常的父本和母本花，分別是父母本的339 %和478 %[14]。推測(cè)可能是不育花中的色氨酸不能被轉(zhuǎn)化成生長(zhǎng)素，而導(dǎo)致在不育花中積累的結(jié)果。同時(shí)，分析茶樹(shù)花不育基因的KEGG代謝通路發(fā)現(xiàn)了參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相關(guān)基因包括生長(zhǎng)素輸入載體(AUX1/LAX)、生長(zhǎng)素反應(yīng)蛋白(AUX/IAA)家族、生長(zhǎng)素響應(yīng)(GH3)家族、生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(ARF)家族以及SAUR家族等基因在不育花中均存在差異表達(dá)，說(shuō)明了不育花中的生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不正常[12]。

4 結(jié) 論

基于上述對(duì)茶樹(shù)YUCCA10基因的表達(dá)特性分析以及前期分析不育花中的色氨酸和生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因。初步推測(cè)是由于不育花中YUCCA10基因的表達(dá)量低，使依賴于色氨酸的生長(zhǎng)素生物合成量少，導(dǎo)致不育花中IAA含量低，影響了生長(zhǎng)素信號(hào)通道途徑，導(dǎo)致茶花發(fā)育不正常，引起茶花不育。