黃 萍,李 飛,顏 謙

(貴州省馬鈴薯研究所，貴州 貴陽 550006)

【研究意義】為馬鈴薯凍害問題提供有效的解決方法?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】用愈傷組織為誘變受體材料的相關(guān)報(bào)道較少，而用愈傷組織作為誘變受體材料，雖操作較為復(fù)雜，但因其可以降低產(chǎn)生嵌合體的幾率，所以更容易得到穩(wěn)定、可遺傳的變異類型，是誘變育種的理想材料。常規(guī)雜交育種技術(shù)選育抗寒突變體具耗時長、難度大的缺點(diǎn)，而EMS誘變育種具有變異頻率高、可改變單一不良性狀、變異效應(yīng)較易穩(wěn)定、育種周期短等優(yōu)點(diǎn)[1]。柳永強(qiáng)、王淼、楊乾等[2-4]用EMS誘變馬鈴薯，并獲得突變株系，但他們都是用馬鈴薯試管苗的莖段作為誘變受體材料。【本研究切入點(diǎn)】馬鈴薯栽培種雖喜涼，但不耐霜凍，冬季低溫常會對馬鈴薯造成霜凍危害[5]。溫度低于1 ℃馬鈴薯植株停止生長，-0.8 ℃時遭受冷害，-1.5 ℃時遭受凍害，-3 ℃時植株會凍死[6]。因立體氣候特點(diǎn)使貴州省周年均可種植馬鈴薯，但早春種植的馬鈴薯在苗期常會遭倒春寒危害，而秋季種植的馬鈴薯在塊莖膨大期也會遭受低溫、早霜或晚霜的影響，使塊莖生長受阻，導(dǎo)致減產(chǎn)，影響農(nóng)戶收入[7]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以貴州省栽培面積較大的馬鈴薯品種費(fèi)烏瑞它試管苗愈傷組織為誘變材料，采用EMS誘變和Hyp壓力選擇正向突變體，得到高脯氨酸變異系，經(jīng)抗低溫特性及相關(guān)生理生化特性研究，篩選出抗寒突變體。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以馬鈴薯栽培品種費(fèi)烏瑞它為試驗(yàn)材料，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室莖尖剝離培養(yǎng)、病毒檢測獲得脫毒試管苗。

1.2 愈傷組織誘導(dǎo)

將馬鈴薯品種費(fèi)烏瑞它脫毒試管苗莖段切成長0.3～0.5 cm的小段，接種到MS+BA2.0 mg/L+2,4-D 1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L、pH=6的培養(yǎng)基上，用三角瓶培養(yǎng)，每瓶接種6段，在(23±2) ℃、1000 lx、光照10 h/d條件下誘導(dǎo)愈傷。

1.3 愈傷組織分化

將愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L、pH=6上，在(23±2) ℃、2000 lx、光照14 h/d條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織萌發(fā)情況。

萌發(fā)率(%)=不定芽數(shù)量/愈傷組織總數(shù)×100

1.4 再生不定芽增殖

當(dāng)不定芽長到2.0 cm時轉(zhuǎn)接到MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH=6的培養(yǎng)基上，在(20±2) ℃、2000 lx、光照14 h/d條件下增殖培養(yǎng)。

1.5 EMS誘變處理愈傷組織

EMS溶液用0.01 mol/L、pH=7的磷酸緩沖液配制，過濾滅菌，以不含EMS的磷酸緩沖液為對照(CK),誘變濃度分別設(shè)為0.4 %、0.8 %、1.2 %和1.6 %。

在無菌操作臺上，將愈傷組織切成大小約3 mm的小塊，分別在不同濃度的溶液中浸泡1、2、3、4 h(期間不停地?fù)u動)后，用無菌水沖洗干凈，分別接種于愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，7～10 d觀察愈傷組織成活率，重復(fù)3次。

愈傷組織成活率(%)=存活愈傷組織數(shù)量/愈傷組織總數(shù)×100。

1.6 L-Hyp濃度篩選

將對照愈傷組織小塊分別接種到添加0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 g/L的L-Hyp誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于溫度為(23±2) ℃、黑暗培養(yǎng)7～10 d，觀察愈傷組織成活率，獲得L-Hyp的半致死劑量。

將EMS誘變處理培養(yǎng)7～10 d的愈傷組織小塊接種在含L-Hyp的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10 d，篩選成活的愈傷組織，轉(zhuǎn)接到不含L-Hyp的培養(yǎng)基上，用含L-Hyp和不含L-Hyp的培養(yǎng)基交替篩選愈傷組織，重復(fù)3次，篩選出抗寒愈傷組織。

1.7 抗寒愈傷組織再分化誘導(dǎo)

將篩選出的抗性愈傷組織增殖后，接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于(20±2) ℃、2000 lx、光照14 h/d條件下培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織萌發(fā)情況(芽分化率=萌發(fā)不定芽數(shù)/愈傷組織總數(shù))。當(dāng)不定芽長到2.0 cm時，轉(zhuǎn)接到MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L、pH=6的培養(yǎng)基上，在(20±2) ℃、2000 lx、光照14 h/d條件下增殖培養(yǎng)。

1.8 抗寒再生苗耐冷性生理指標(biāo)測定

將獲得的抗性株系試管苗分別放在20 ℃、7 ℃、0 ℃、-1 ℃、-2 ℃、-4 ℃、-6 ℃下7 d，采用黃基水楊酸法測定各處理脯氨酸含量，以未經(jīng)EMS誘變的愈傷組織再生苗為對照。將獲得的抗性株系試管苗分別放在20 ℃、0 ℃、-1 ℃、-2 ℃、-3 ℃、-4 ℃下5 d，取出后用DDS-307型電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率R1，將材料放入沸水浴中水浴20 min以殺死植物組織，取出后迅速用自來水冷卻，測定電導(dǎo)率R2，計(jì)算相對電導(dǎo)率=R1/R2×100 %。以未經(jīng)EMS誘變的愈傷組織再生苗為對照。

1.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel和DPS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)分化及增殖培養(yǎng)

將費(fèi)烏瑞它試管苗莖段接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，莖段兩端開始膨大呈啞鈴狀。培養(yǎng)25 d后，莖段兩端繼續(xù)膨大變粗，中部加粗。培養(yǎng)40 d，莖段切口處長出肉眼可見的愈傷組織，少部分材料有根形成，長度大約1 cm，上有許多根毛。培養(yǎng)60 d，90 %接種材料形成愈傷組織，有9.76 %的愈傷上有根形成，長度約2.47 cm，此時愈傷組織平均重0.248 g，淡綠色，結(jié)構(gòu)較致密。而對照無愈傷組織形成，接種材料變白死亡。選取生長良好的愈傷組織60塊接入分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。30 d愈傷組織表面形成瘤狀突起，培養(yǎng)50 d有6.78 %的愈傷組織小芽。培養(yǎng)70 d有28個愈傷組織有小苗形成，最高的苗4.61 cm，愈傷組織誘導(dǎo)芽形成率是47.5 %。分化出來的健壯小苗轉(zhuǎn)接到不含激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30 d左右可用于擴(kuò)繁。

2.2 EMS處理費(fèi)烏瑞它愈傷組織的生長情況

從表1可知，在相同的EMS濃度下，隨著處理時間的增加，愈傷組織存活率降低；在相同的處理時間內(nèi)，隨著EMS濃度的增加，愈傷組織存活率也降低。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，當(dāng)EMS度為0.4 %時，處理1～4 h對愈傷組織的殺傷力相對較弱，其存活率仍然能達(dá)到70 %以上；其次是0.8 %的EMS處理，此時愈傷組織仍有40 %以上的存活率；當(dāng)EMS濃度大于1.2 %后對愈傷組織的傷害作用較強(qiáng)，存活率不到40 %。根據(jù)處理后愈傷組織致死率結(jié)果，篩選出EMS半致死濃度為0.8 %、處理時間為4 h較佳。

2.3 L-Hyp處理費(fèi)烏瑞它愈傷組織的生長情況

從表2看出，愈傷組織在不添加L-Hyp的培養(yǎng)基上培養(yǎng)成活率達(dá)98 %，隨著L-Hyp濃度的增加，成活率逐漸下降。當(dāng)濃度增加到0.4 %時，存活率為52.2 %；當(dāng)L-Hyp增加到0.6 %時，成活率最低，僅有13.4 %。L-Hyp對費(fèi)烏瑞它愈傷組織的半致死劑量為0.4 %，但兼顧成活率和變異頻率相對較高考慮，選擇0.5 %為L-Hyp的半致死劑量濃度。

表1 EMS處理費(fèi)烏瑞它愈傷組織的存活率

表2 不同濃度L-Hyp處理費(fèi)烏瑞它愈傷組織的成活率

2.4 L-Hyp對EMS誘變愈傷組織的篩選

從表3看出，經(jīng)EMS誘變處理后的愈傷組織在L-hyp上成活率高于對照，且成活的愈傷組織多數(shù)無褐化、生長良好，而對照經(jīng)L-Hyp篩選后成活的愈傷組織大多數(shù)表現(xiàn)為褐化。表明經(jīng)EMS誘變的部分愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生了抗L-Hyp變異。

2.5 L-hyp抗性愈傷組織分化

抗性愈傷組織誘導(dǎo)成芽的時間較長，為89 d，比對照的75 d多14 d。在愈傷誘導(dǎo)芽分化期間，有15個抗性愈傷組織褐化面積不斷加大，最后死亡，剩余的12個抗性愈傷組織中有7個誘導(dǎo)出抗性再生苗，每個抗性再生苗為一個株系共7個；而對照的愈傷即使未分化出芽，但顏色一直是淡綠色，未發(fā)生大面積褐化。從表4看出，經(jīng)EMS和L-Hyp篩選后的愈傷組織芽分化率低于對照，只有25.9 %，比對照低18.5百分點(diǎn)。一定程度上說明EMS對愈傷組織傷害的持續(xù)性，致使愈傷的生長分化受到抑制。

表3 EMS誘變處理后的愈傷組織在L-hyp上的成活率及生長情況

表4 L-Hyp抗性愈傷組織分化

2.6 抗性再生苗耐凍性生理指標(biāo)

2.6.1 脯氨酸含量 從表5看出，在所設(shè)溫度范圍內(nèi)隨溫度降低，抗性系內(nèi)脯氨酸含量均明顯增加，-3 ℃溫度處理后，脯氨酸含量開始降低；低溫處理后抗性系內(nèi)脯氨酸含量明顯高出對照，比值大于1。7個抗性株系中，株系1的脯氨酸含量最高，其次是抗性4系，抗性3系、2系、5系和6系間差異性不顯著，7系最低。

2.6.2 電導(dǎo)率 從表6看出，隨溫度降低，對照與抗性株系相對電導(dǎo)率均顯著增加，但對照增加幅度明顯高出各變異株系，-2 ℃和-4 ℃處理后，對照相對電導(dǎo)率分別是57.92和61.91，而在變異株系中電導(dǎo)率增加幅度最大的是變異株6號，分別是44.39和49.83；其次是7號，抗性系5、3、2號間變化不顯著，抗性系4號和1號電導(dǎo)率變化最低。在所設(shè)溫度處理下，對照和變異株系電導(dǎo)率增加速度不一致，20～-2 ℃情況下電導(dǎo)率增加幅度顯著大于-4～-6 ℃。

表5 不同溫度下7個抗性株系的脯氨酸含量

注：表中大、小寫字母分別表示各變異株系間脯氨酸含量分別達(dá)1 %極顯著水平和5 %顯著水平。

Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicate significant differences at 1 % and 5 % levels respectively.

表6 不同溫度下7個抗性株系的電導(dǎo)率

3 討 論

植物EMS離體篩選技術(shù)是植物抗逆育種的一項(xiàng)快速有效選擇方法，已廣泛應(yīng)用于水稻、玉米、小麥上。影響EMS誘變效果的主要因素有外植體選擇、EMS濃度、處理時間及處理方法等[8]。確定EMS的濃度和處理時間時，通常以半致死劑量條件作為最適條件[9-10]。采用馬鈴薯試管苗莖段愈傷組織作試驗(yàn)外植體，由于其本身已開始形成點(diǎn)狀突起且生長處于旺盛時期，這樣的外植體對化學(xué)誘變劑具有一定的敏感性。EMS不僅在誘變處理過程中會導(dǎo)致愈傷組織毒害和死亡，而且在誘變后愈傷組織分化過程中還會表現(xiàn)明顯的殘留，更有利于獲得突變體材料。

試驗(yàn)用EMS誘變費(fèi)烏瑞它愈傷組織，經(jīng)不同濃度L-Hyp篩選獲得7個變異株系。經(jīng)脯氨酸和電導(dǎo)率測定，其保持了高脯氨酸特性和耐低溫能力，與對照存在顯著差異，初步認(rèn)定為抗寒變異系，但要獲得更多的遺傳學(xué)方面和分子方面的證據(jù)，還要對其有性世代耐低溫能力和基因組進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，篩選出的7個株系具有一定抗寒性，但各個抗寒能力存在差異。具體哪個抗寒能力最強(qiáng)，還有待后期大田試驗(yàn)驗(yàn)證。