程凱慧 朱彤 任亞初 張?jiān)骑w 楚會(huì)萌 解曉莉 張亮 楊宏軍

摘要：利用MDBK細(xì)胞從奶牛卵巢中分離到一株牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）毒株。設(shè)計(jì)擴(kuò)增IBRV的通用引物，對(duì)卵巢組織中的病毒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及測(cè)序;對(duì)卵巢組織感染MDBK細(xì)胞，進(jìn)行IBRV的分離培養(yǎng);測(cè)定IBRV的TCID?50，同時(shí)利用IBRV FA 進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，分離到的病毒在MDBK細(xì)胞上產(chǎn)生了明顯的病變;用特異性引物可擴(kuò)增出特異性目的條帶，目的序列與IBRV基因序列一致;該毒株的病毒滴度為106.75 TCID?50/mL。

關(guān)鍵詞：卵巢;牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）;鑒定;細(xì)胞病變;TCID?50

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65+9.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）02-0117-04

Isolation and Identification of an IBRV Strain from Cow Ovary

Cheng Kaihui， Zhu Tong， Ren Yachu， Zhang Yunfei，

Chu Huimeng， Xie Xiaoli， Zhang Liang， Yang Hongjun

（Dairy Cattle Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 25013?China）

AbstractA strain of IBRV was isolated from cow ovary with MDBK cells. The universal primer of IBRV was designed and amplified， and the ovarian tissue was used for PCR and sequencing. The ovarian tissue infected MDBK cells to isolate the IBRV; the TCID?50 of IBRV was determined and it was identified with IBRV FA. The results showed the cytopathic effect （CPE） generated in MDBK. The specific bands could be amplified by PCR with IBRV primers. The sequencing results showed that the sequence was coincided with the published IBRV sequence. The virus titration of the strain was 106.75 TCID?50/mL.

KeywordsOvary; IBRV; Identification; Cytopathic effect （CPE）; TCID?50

牛傳染性鼻氣管炎病毒 （infectious bovine rhinotracheitis virus， IBRV） 又稱(chēng)牛皰疹病毒Ⅰ型 （bovine herpesvirus ?BHV-1），是皰疹病毒科（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）水痘病毒屬 （Varicellovirus）的成員。牛傳染性鼻氣管炎（IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、流鼻汁、上呼吸道及氣管、黏膜發(fā)炎等為特征，還可造成生殖道感染、結(jié)膜炎、腦膜腦炎、流產(chǎn)和死胎、乳房炎等多種臨床癥狀[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將該病列為B類(lèi)疾病，也是我國(guó)進(jìn)境動(dòng)物必檢疾病之一。IBRV廣泛分布于世界各地，每年給各國(guó)造成高達(dá)30億～60億美元經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了養(yǎng)牛業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[2]。

20世紀(jì)50年代首次在北美發(fā)現(xiàn)牛傳染性鼻氣管炎，70年代我國(guó)在進(jìn)口的種牛中發(fā)現(xiàn)該病[3]，迄今已成為全球性重要疾病。國(guó)外疫苗接種后IBRV 抗體陽(yáng)性率達(dá)24.00%～66.67%[4， 5];羅玉江、馮蒙等分別報(bào)道了我國(guó)不同省市IBRV 的流行情況，陽(yáng)性率為41.6%～54.1%[6-9];本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)山東省部分奶牛場(chǎng)進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)平均感染率為26.67%，但是奶牛卵巢中IBRV的感染率為57.00%，是病毒性卵巢炎的主要病原，給牧場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。IBRV可以在原代細(xì)胞或牛腎、肺、睪丸、鼻甲或氣管等組織細(xì)胞及已建立的細(xì)胞系如牛腎細(xì)胞（MDBK）中分離獲得。樣品多為鼻腔拭子、咽拭子、陰道拭子、包皮清洗液、流產(chǎn)胎兒的胎盤(pán)、脾、肺、腎等。鄧沛霖、孔繁德[10，11]等從牛群的陽(yáng)性血清中分離到該病毒，目前沒(méi)有從卵巢中分離到該病毒的報(bào)道。本研究從無(wú)明顯臨床癥狀的奶牛卵巢中分離到一株IBRV 病毒，并經(jīng)測(cè)序等試驗(yàn)進(jìn)行確定。

1材料與方法

1.1樣品來(lái)源

奶牛卵巢來(lái)自山東省定點(diǎn)奶牛屠宰場(chǎng)。

1.2主要試劑與儀器

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，2×Easy Taq PCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，IBRV FA 熒光抗體購(gòu)自青島瑞爾生物技術(shù)有限公司，MDBK細(xì)胞為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心疾病研究室保存。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中牛傳染性鼻氣管炎病毒的全基因組核酸序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增牛傳染性鼻氣管炎病毒的通用引物，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，引物序列如表1。

1.4樣品的處理

取奶牛一對(duì)卵巢的部分組織進(jìn)行研磨，反復(fù)凍融3次，用PBS稀釋相應(yīng)的樣本，5 000 r/min 離心5 min，取上清液加入青霉素 （200 IU/mL） 、鏈霉素 （100 μg/mL），用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20℃保存。

1.5病毒DNA的提取及PCR鑒定

取200 μL卵巢組織上清液，按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取IBRV病毒基因組DNA。以提取的IBRV病毒基因組DNA為模板，IBRV-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：DNA模板2 μL，Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，去離子水補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃ 5 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.6IBRV病毒的分離

選擇生長(zhǎng)旺盛的MDBK單層細(xì)胞，傾去生長(zhǎng)液，PBS清洗兩次，接種處理好的卵巢組織上清液1 mL，37℃吸附1 h，棄去組織液，加入含有2% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h觀察細(xì)胞病變情況，連續(xù)觀察7 d。將出現(xiàn)病變（CPE）的細(xì)胞反復(fù)凍融3 次，收集細(xì)胞病毒液，用細(xì)胞病毒液再接種MDBK細(xì)胞;沒(méi)有出現(xiàn)CPE的細(xì)胞進(jìn)行盲傳，盲傳到第3代，仍沒(méi)有出現(xiàn)CPE，視為陰性。

1.7IBRV病毒TCID?50的測(cè)定

將分離到的IBRV病毒液做連續(xù)10倍的稀釋?zhuān)?0-1～10-10），將稀釋好的病毒液接種到已長(zhǎng)好MDBK單層細(xì)胞的96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種3孔，每孔接種100 μL，同時(shí)設(shè)置正常的細(xì)胞作為對(duì)照。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入維持液100 μL，繼續(xù)在 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察CPE，連續(xù)觀察5 d，按Reed-Muench法計(jì)算TCID?50。

1.8IBRV FA觀察熒光抗體

將觀察完CPE的96孔培養(yǎng)板棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3遍，拍干;室溫用5%的多聚甲醛固定10 min，棄去固定液，自然晾干，再用PBS洗滌3遍，拍干;加入50 μL IBRV FITC熒光抗體，37℃孵育30 min。用PBST洗滌，拍干，在熒光顯微鏡下觀察熒光。

2結(jié)果與分析

2.1IBRV的PCR 鑒定

用IBRV的特異性引物對(duì)卵巢組織上清液進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照，擴(kuò)增目的片段大小為362 bp，PCR產(chǎn)物測(cè)序序列經(jīng)BLAST比對(duì)，與IBRV基因序列一致。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，114份奶牛卵巢組織IBRV感染率為57%（65/114），部分檢測(cè)結(jié)果如圖1。

2.2IBRV的分離

從114份卵巢組織中選取10份在MDBK細(xì)胞上進(jìn)行分離，其中編號(hào)為53號(hào)的卵巢組織在細(xì)胞上傳至第二代出現(xiàn)明顯的CPE，細(xì)胞圓縮、拉網(wǎng)，聚集成葡萄串樣，在單層細(xì)胞上形成空洞，48 h內(nèi)CPE達(dá)到80%左右，細(xì)胞大部分脫落。收集到的細(xì)胞液經(jīng)IBRV特異性引物擴(kuò)增，鑒定為陽(yáng)性。

2.3IBRV的TCID?50

顯微鏡下觀察每個(gè)稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)（表2），同時(shí)結(jié)合IBRV FA 熒光抗體的數(shù)據(jù)，按Reed-Muench法計(jì)算IBRV的TCID?50，分離到的該株IBRV病毒滴度為106.75 TCID?50/mL。

2.4IBRV FA結(jié)果

在熒光顯微鏡下，10-1～10-5稀釋度均能觀察到熒光，10-6稀釋度只有一個(gè)孔能看見(jiàn)熒光，細(xì)胞呈現(xiàn)脫落、拉網(wǎng)的狀態(tài)（圖2），稀釋度越大熒光數(shù)目越少。

3討論與結(jié)論

牛傳染性鼻氣管炎是由IBRV引起的一種牛急性接觸性傳染病，可通過(guò)氣溶膠、病牛的直接接觸等方式傳播，但主要是飛沫經(jīng)呼吸道傳播，可形成潛伏感染和持續(xù)性感染，對(duì)牛生殖道和生殖器官有嚴(yán)重影響，包括流產(chǎn)和呼吸道疾病。病牛和帶毒動(dòng)物是主要傳染源，隱性傳染的種公牛因精液帶毒，是最危險(xiǎn)的傳染源。病愈?？蓭Ф景肽甑揭荒?，甚至更長(zhǎng)，隨著我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，牛傳染性鼻氣管炎的威脅也與日俱增。

IBRV病毒能通過(guò)血液到達(dá)生殖道，影響生殖器官，卵巢是主要的靶器官。 1985年Van der Maaten等[12]研究發(fā)現(xiàn)，從未感染IBRV的奶牛配種后接種IBRV，對(duì)其卵巢產(chǎn)生多種影響。目前分離鑒定到的IBRV毒株多數(shù)是從鼻拭子、血液中分離到，還沒(méi)有從卵巢中分離到IBRV的報(bào)道。

本研究利用MDBK細(xì)胞，首次從奶牛卵巢中分離出1株IBRV，測(cè)序后顯示與IBRV基因序列一致;該病毒在MDBK細(xì)胞上盲傳后能明顯觀察到CPE，用IBRV熒光抗體感染可以看到免疫熒光，說(shuō)明該分離株為牛傳染性鼻氣管炎病毒。該研究結(jié)果為今后開(kāi)展IBRV流行病學(xué)調(diào)查、篩選和選育疫苗候選毒株及診斷方法的研究提供了有價(jià)值的毒株，同時(shí)為該病的防控提供理論支撐。

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