解曉莉 孫陽陽 程凱慧 楚會萌 張亮 王基隆 楊美 楊宏軍

摘要：本研究以腹瀉牛糞便基因組DNA為模板，擴(kuò)增MAP0862基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-30a（+）-MAP0862和pEGX-6P-1-MAP0862，通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白，經(jīng)純化后制備兔源高免血清，建立ELISA特異性檢測方法，最后將純化蛋白和ELISA方法用于牛副結(jié)核病臨床樣品檢測，并對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，以MAP0862蛋白為檢測原建立的ELISA檢測方法在臨床樣品檢測中具有較高的特異性和敏感性，說明MAP0862蛋白適用于副結(jié)核病抗體檢測。本研究建立的ELISA檢測方法可有效檢測臨床樣品中副結(jié)核病的感染。

關(guān)鍵詞：副結(jié)核病;MAP0862蛋白;ELISA;副結(jié)核分枝桿菌

中圖分類號：S852.61+8文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）02-0111-06

Expression and Clinical Significance of Mycobacterium

avium subsp. paratuberculosis MAP0862 Protein

Xie Xiaoli， Sun Yangyang， Cheng Kaihui， Chu Huimeng，

Zhang Liang， Wang Jilong， Yang Mei， Yang Hongjun

（Dairy Cattle Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250131，China）

AbstractThe MAP0862 gene was cloned from fecal genome of diarrhea cattles. The pET-320（+）-MAP0862 and pEGX-6P-1-MAP0862 expression vector were constructed to express the His-MAP0862 and GST-MAP0862 proteins. The recombinant proteins were used to obtain immune serum after purification， and the ELISA method was established. The MAP0862 protein and ELISA method were used to detect paratuberculosis. The results showed that there was highly specificity and sensitivity in ELISA test using MAP0862 protein as stimulator， so it was confirmed that MAP0862 protein was optimal for antibody detection of paratuberlosis. The ELISA method established based on MAP0862 protein could detect paratuberculosis effectively in clinical samples.

KeywordsParatuberculosis; MAP0862 protein; ELISA; Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis （MAP）

副結(jié)核?。╬aratuberculosis）是一種由副結(jié)核分支桿菌即禽分枝桿菌副結(jié)核亞種（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis，MAP）引起的以慢性增生性、頑固性腸炎和進(jìn)行性消瘦為特征的傳染病[1，2]，具有強(qiáng)烈的傳染性，而且可垂直傳播。副結(jié)核分枝桿菌主要感染反芻動物，如牛、山羊、綿羊和鹿等，也可感染部分野生非反芻獸[3]。牛在一歲前最易感染MAP，但直到2～5歲才會出現(xiàn)臨床癥狀，導(dǎo)致頑固性腹瀉、消瘦、產(chǎn)奶量和繁殖力嚴(yán)重下降至喪失，最終導(dǎo)致淘汰。另外，有報(bào)道指出，牛副結(jié)核分枝桿菌與人的局限性腸炎以及HIV和其他免疫缺陷病的感染有關(guān)[4-9]。

副結(jié)核分支桿菌感染后機(jī)體的免疫應(yīng)答在感染初期以細(xì)胞免疫為主，皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢出率高，但隨著病情的發(fā)展，細(xì)胞免疫應(yīng)答逐漸減弱而體液免疫應(yīng)答逐漸增強(qiáng)[10-12]。MAP對牛的持續(xù)性感染可以分為兩個階段，首先是MAP感染宿主進(jìn)入腸道，然后進(jìn)入巨噬細(xì)胞[13]，并在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存和增殖[14]，從而導(dǎo)致MAP的持續(xù)性感染。而MAP特異性基因編碼的蛋白是影響MAP在巨噬細(xì)胞內(nèi)定殖和發(fā)揮致病力的重要因素[15，16]。另外，由于MAP特異性抗原可以區(qū)別于環(huán)境中的分枝桿菌尤其是禽分枝桿菌，所以其在副結(jié)核病的診斷方面具有良好的敏感性和特異性。因此，眾多學(xué)者開展了MAP特異性抗原的分析工作，并鑒定出一些具有診斷價值的抗原[17，18]，如MAP0862、MAP2154c等。

MAP0862蛋白是MAP特異性抗原，在副結(jié)核診斷中具有良好的特異性和靈敏性。本研究從成母牛的腹瀉糞便中提取基因組DNA，擴(kuò)增克隆MAP0862基因，并體外表達(dá)純化相關(guān)蛋白，建立ELISA和早期檢測方法，應(yīng)用于牛副結(jié)核病的臨床診斷，以評價其臨床診斷應(yīng)用價值。

1材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株及主要試劑

pMD-20T克隆載體、感受態(tài)DH5α、BL21（DE3）、蛋白質(zhì)Marker均購自北京TransGen Biotech;pET-30a（+）和pEGX-6P-1由本實(shí)驗(yàn)室保存;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ及DNA Marker均購于大連寶生物工程有限公司;Anti-His mAb和Anti-GST mAb及羊抗鼠IgG-HRP購自Sigma公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;DNA回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒均購自北京TianGen Biotech;His-Bind Purification Kit和GST-tag Protein Purification Kit購自Novagen公司;試驗(yàn)用雌兔購于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種兔實(shí)驗(yàn)基地。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2副結(jié)核分支桿菌基因擴(kuò)增模板的選取

取少量腹瀉牛糞便于無菌離心管內(nèi)，加入無菌SW，振蕩混勻，10 000 r/min離心3 min，棄上清，用糞便基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

根據(jù)GenBank中IS900序列（CP005928）設(shè)計(jì)引物，由北京華大生物科技有限公司合成，序列為：F：5′-CTGGCTACCAAACTCCCGA-3′，R：5′-GAACTCAGCGCCCAGGAT-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段長度為314 bp，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定正確的總DNA作為MAP0862基因擴(kuò)增的模板。

1.3MAP0862基因的克隆

根據(jù)GenBank中MAP0862基因序列（NC_002944.2）設(shè)計(jì)引物，由北京華大生物科技有限公司合成，引物序列為：Ps1：5′-CAGGATCCATGCGCTTCGTAAACGGCAA-3′（BamHⅠ），Pa1：5′-ATGAATTCTCAGGCGCGCCACAGATTT-3′（EcoRⅠ），預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段長度為1 083 bp。參照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行RT-PCR、連接、轉(zhuǎn)化、篩選、酶切和測序鑒定，將重組質(zhì)粒命名為pMD-20T-MAP0862。利用NCBI中的BLAST進(jìn)行MAP0862氨基酸序列比對。

1.4重組MAP0862蛋白的表達(dá)與鑒定

將重組質(zhì)粒pMD-20T-MAP0862和pET-30a（+）、pEGX-6P-1同時使用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3）中構(gòu)建重組菌（pET-30a（+）-MAP0862/BL21）和（pEGX-6P-1-MAP0862/BL21）。同上方法進(jìn)行篩選、酶切和測序鑒定。取鑒定正確的菌液培養(yǎng)，經(jīng)IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）30℃誘導(dǎo)后，超聲波裂解離心取上清。使用His-Bind Purification Kit和GST-tag Protein Purification Kit純化His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白，使用超濾柱對純化的蛋白進(jìn)行除鹽濃縮。參照文獻(xiàn)[12]的方法以Anti-His mAb和Anti-GST mAb （1∶2 000）為一抗，羊抗鼠IgG-HRP（1：4 000）為二抗，ECL顯色，進(jìn)行Western blot鑒定。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）對純化蛋白濃度進(jìn)行測定。

1.5MAP0862蛋白高免血清的制備

免疫前對家兔耳緣靜脈采血，收集血清，以備后續(xù)檢測使用。以純化的His-MAP0862蛋白為免疫原，與等體積的弗氏完全佐劑充分混合均勻，對家兔（2 kg/只，雌性）進(jìn)行皮下多點(diǎn)免疫，免疫劑量為1.0 mg/只。分別于首次免疫兩周和四周后，將His-MAP0862蛋白和弗氏不完全佐劑等體積混合免疫家兔。于第三次免疫兩周后，收集少量血清進(jìn)行抗體水平分析，抗體大量產(chǎn)生后處死家兔，收集血清。

1.6MAP0862抗體檢測ELISA方法的建立

使用包被液（Na2CO3/NaHCO3緩沖液，pH值9.6）稀釋GST-MAP0862蛋白分別為0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL和20.0 μg/mL作為包被抗原，100 μL/孔，置于4℃過夜包被;用PBST洗板，然后加入10%小牛血清，200 μL/孔封閉2 h;用PBST洗板，然后加入1∶100、1∶200、1∶400到1∶102 400倍比稀釋的血清，以PBS為空白對照，100 μL/孔，37℃孵育2 h;用PBST洗板，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（用PBST進(jìn)行1∶5 000稀釋），100 μL/孔，37℃孵育1 h;用PBST洗板，加入TMB顯色液，100 μL/孔，避光反應(yīng)10～15 min后，加入終止液（2 mol/L H2SO4）50μL/孔，讀取吸光值（OD?492）。經(jīng)多次調(diào)整抗原包被濃度和血清稀釋度后，確定GST-MAP0862抗原的最佳包被濃度，建立MAP0862抗體檢測方法。并以建立的ELISA方法對高免血清抗體效價進(jìn)行評定。

1.7MAP0862在臨床檢測上的應(yīng)用

1.7.1ELISA方法檢測牛群中副結(jié)核病的感染情況采集牛頸靜脈或尾靜脈血于促凝管中，收集血清。用愛德士的牛副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒和上述建立的MAP0862間接ELISA檢測方法，分別對收集的血清進(jìn)行ELISA檢測。具體步驟參照試劑盒說明書和上述ELISA檢測方法建立步驟。整理檢測結(jié)果，對兩種檢測方法在副結(jié)核病檢測中的特異性和敏感性進(jìn)行比對分析。

1.7.2皮膚變態(tài)反應(yīng)檢測牛群中副結(jié)核病的早期感染情況將牛在頸夾保定的基礎(chǔ)上進(jìn)行頭部安全固定，充分暴露出頸部，在頸部相聚10 cm以上的部位選取兩點(diǎn)分別作為副結(jié)核菌素和MAP0862蛋白的注射點(diǎn)，剃毛。然后用電子游標(biāo)卡尺測量注射點(diǎn)的皮膚厚度，記錄數(shù)據(jù)。消毒后，在兩個注射點(diǎn)分別皮內(nèi)注入0.1 mL的副結(jié)核菌素（0.5 mg/mL）和MAP0862蛋白（0.05 mg/mL，高純蛋白使用濃度為副結(jié)核菌素的1/10）。注射72 h后測量注射點(diǎn)的皮膚厚度，記錄數(shù)據(jù)。分析注射前后皮膚厚度差，判斷牛只副結(jié)核分支桿菌感染狀態(tài)。對比結(jié)果，分析MAP0862蛋白和副結(jié)核菌素作為副結(jié)核病檢測刺激原的特異性和敏感性。

1.7.3IFN-γ釋放試驗(yàn)檢測牛群中副結(jié)核病的早期感染情況無菌采集牛頸靜脈或尾靜脈血5 mL于含肝素鋰或肝素鈉的抗凝管中，輕輕顛倒混勻防止部分血液發(fā)生凝血。無菌條件下將血液分裝至3個無菌離心管內(nèi)，1.5 mL/支，分別加入100 μL PBS，副結(jié)核菌素（200 IU）和MAP0862蛋白（20 μg/mL），充分混勻，37℃孵育16～24 h。500×g離心10 min后，將上層血漿轉(zhuǎn)移到新的離心管中。根據(jù)Prionics公司的Bovigam牛結(jié)核分枝桿菌γ干擾素ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行接下來的ELISA檢測，讀取OD?450的吸光度，分析牛群的感染情況及兩種刺激原在此方法應(yīng)用中的特異性及敏感性。

1.7.4MAP0862蛋白在副結(jié)核病診斷中的應(yīng)用前景分析匯總數(shù)據(jù)，分析MAP0862蛋白和副結(jié)核菌素在副結(jié)核病診斷中的結(jié)果符合率及各刺激原在檢測中的特異性及敏感性。

2結(jié)果與分析

2.1MAP0862基因的克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建

以臨床上篩選到的陽性糞便樣品全基因組DNA為模板，成功擴(kuò)增1 083 bp的MAP0862基因（圖1），經(jīng)測序鑒定正確無突變。

MAP0862重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，得到1 083 bp的目的片段（圖2），BLAST比對結(jié)果顯示該基因與NCBI公布的相應(yīng)序列同源性均為100%，重組質(zhì)粒均構(gòu)建正確。

2.2MAP0862蛋白的表達(dá)與鑒定

將原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE與Western blot（圖3）分析顯示，His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白均已表達(dá)，且大小與預(yù)期大小（分別為44 kD和64 kD）一致。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測得純化的His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白濃度分別為1.5 mg/mL和1.0mg/mL。

2.3MAP0862間接ELISA檢測方法的建立

根據(jù)不同包被濃度下空白對照和陰性值以及不同濃度抗體與抗原的反應(yīng)情況，最終確定MAP0862蛋白的包被濃度為2 μg/mL，樣品OD?450≥0.25且樣品OD?450/陰性O(shè)D?450≥2時認(rèn)為抗體陽性，否則為陰性。利用建立的ELISA方法，測定制備的兔源多抗的效價達(dá)1∶106（圖4）。結(jié)果表明MAP0862具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。

2.4MAP0862蛋白在臨床診斷中的應(yīng)用

2.4.1ELISA方法檢測牛群中副結(jié)核病的感染情況收集274份牛血清進(jìn)行牛副結(jié)核病抗體ELISA檢測，結(jié)果顯示，愛德士的牛副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒檢測出抗體陽性59頭份，MAP0862抗原檢測出抗體陽性48頭份，其中一頭愛德士試劑盒檢測為可疑（列入陰性群）的牛只MAP0862蛋白檢測抗體陽性。兩種檢測方法的符合率達(dá)95.26%。具體分析結(jié)果見表1。

2.4.2皮膚變態(tài)反應(yīng)檢測牛群中副結(jié)核病的早期感染情況皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)共檢測牛只100頭份，根據(jù)《中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1084-2010》和OIE 2014年5月頒布的副結(jié)核病皮試檢測判斷標(biāo)準(zhǔn)：皮厚差>2 mm即判為副結(jié)核陽性，≤2 mm則為副結(jié)核陰性。結(jié)果顯示副結(jié)核菌素作為檢測原檢測陽性11頭份，MAP0862蛋白作為檢測原檢測陽性7頭份。兩者整體符合率達(dá)82.00%，但陽性符合率為0。具體分析結(jié)果見表2。

2.4.3IFN-γ釋放試驗(yàn)檢測牛群中副結(jié)核病的早期感染情況從上述檢測的100頭份牛只中采取51頭份奶牛抗凝血進(jìn)行IFN-γ釋放試驗(yàn)檢測，結(jié)果顯示，副結(jié)核菌素作為刺激劑檢測陽性15頭份，MAP0862蛋白作為刺激劑檢測陽性15頭份。兩者的整體符合率僅為68.63%。具體分析結(jié)果見表3。

2.4.4MAP0862蛋白在副結(jié)核診斷中的應(yīng)用前景分析將皮膚變態(tài)反應(yīng)和IFN-γ釋放試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示以副結(jié)核菌素作為檢測原，兩種方法的符合率為62.75%;而以MAP0862蛋白作為檢測原，兩種方法的符合率達(dá)73.53%。說明在副結(jié)核病的早期診斷中MAP0862蛋白作為檢測原具有較高的特異性，但相較于副結(jié)核菌素的高陽性檢出率，MAP0862蛋白在副結(jié)核病的早期檢測中的敏感性可能相對較低。而在抗體檢測中，MAP0862蛋白作為檢測原，與商品化的試劑盒檢測結(jié)果的符合率較高，且其作為單一抗原，在檢測的特異性上可能更有優(yōu)勢，因此MAP0862蛋白更適合應(yīng)用于副結(jié)核病的抗體檢測。

3討論與結(jié)論

副結(jié)核病是由副結(jié)核分枝桿菌引起的反芻獸的慢性消化道疾病，以頑固性腹瀉、漸進(jìn)性消瘦、腸黏膜增厚并形成皺襞為特征。本病呈世界性流行，無明顯季節(jié)性，主要呈散發(fā)，有時可呈地方性流行。副結(jié)核病的主要診斷方法為以副結(jié)核提純菌素或禽結(jié)核提純菌素為刺激原或檢測原的皮試檢測和ELISA抗體檢測，但由于副結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群內(nèi)的主要致病菌牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌的同源性較高，相互之間干擾較大，降低了檢測特異性，易引起檢測的假陽性。

MAP0862蛋白為副結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，其可對副結(jié)核病進(jìn)行特異性檢測，不受其他分枝桿菌的影響。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行MAP0862蛋白的體外表達(dá)獲得高純MAP0862蛋白，制備高免血清并建立了ELISA特異性檢測方法。利用此方法對臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，本方法與商品化愛德士試劑盒檢測結(jié)果的符合率達(dá)95.26%，表明此方法具有較好的特異性與敏感性;且其作為單一檢測原，與愛德士試劑盒中以副結(jié)核菌素為檢測原相比，具有更高的特異性。

以MAP0862蛋白作為刺激原通過皮膚變態(tài)反應(yīng)和IFN-γ釋放試驗(yàn)對臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在皮膚變態(tài)反應(yīng)中，MAP0862蛋白與副結(jié)核菌素作為刺激原的檢測結(jié)果的符合率為82.00%;在IFN-γ釋放試驗(yàn)中，MAP0862蛋白與副結(jié)核菌素作為刺激原的檢測結(jié)果的符合率為68.63%。但MAP0862蛋白在兩種方法的檢測中有更高的符合率，表明MAP0862蛋白在副結(jié)核病的早期檢測中有更高的特異性，但其敏感性較低。

本研究結(jié)果表明，MAP0862蛋白在副結(jié)核病的抗體ELISA檢測中具有較好的特異性與敏感性，可用于副結(jié)核病的血清學(xué)抗體檢測。根據(jù)這一結(jié)果推測MAP0862蛋白主要在以體液免疫為主的副結(jié)核病感染中后期參與副結(jié)核病感染。本研究為副結(jié)核病診斷方法的研究提供了借鑒依據(jù)與研究方向，有利于副結(jié)核病診斷方法研究的進(jìn)一步開展。

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