崔德周 李永波 樊慶琦 隋新霞 黃承彥 楚秀生

摘要：為挖掘定位小麥抗紋枯病QTL，以萊州953×山農(nóng)輻63的F?2∶?3為作圖群體，用Illumina Wheat 90K芯片檢測(cè)F?2單株的基因型，并用QTL IciMapping 4.1軟件繪制該群體的遺傳連鎖圖譜;在自然發(fā)病條件下，鑒定分離群體的抗、感表型，利用QTL IciMapping 4.1進(jìn)行抗紋枯病QTL定位分析。結(jié)果表明，構(gòu)建的小麥遺傳連鎖圖譜包含21個(gè)連鎖群，覆蓋了小麥的21條染色體，圖譜總長(zhǎng)度5 528.12 cM，平均圖距5.25 cM;共檢測(cè)到6個(gè)分布于小麥1A、1B、2A、3A、7A和7D染色體上的加性QTL位點(diǎn)，單個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率為3.24%～10.37%。該結(jié)果可為小麥抗紋枯病QTL精細(xì)定位與相關(guān)基因克隆奠定基礎(chǔ)，也為小麥抗紋枯病分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小麥;遺傳連鎖圖譜構(gòu)建;紋枯病;QTL定位;90K芯片SNP標(biāo)記

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.103.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）02-0013-05

Construction of Wheat Genetic Linkage Map Based on 90K SNP

Array and Mapping QTLs for Sharp Eyespot Resistance

Cui Dezhou??Li Yongbo??Fan Qingqi??Sui Xinxia??Huang Chengyan??Chu Xiusheng1，2

（1. Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of

Wheat Biology and Genetic Improvement in the North Yellow﹠Huaihe River Valley， Ministry of Agriculture/

National Engineering Laboratory for Wheat and Maize， Jinan 250100， China;

2. College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China）

AbstractIn order to map the QTLs associated with sharp eyespot resistance in wheat， the F?2∶?3 population was derived from a combination of Laizhou 953 × Shannongfu 63. The genotype of F2 single plant was obtained through the Illumina Wheat 90K SNP array， and the genetic linkage map of the population was constructed using QTL IciMapping 4.1 software. The phenotype of the population was identified under natural conditions， and the QTL mapping was performed by using QTL IciMapping 4.1 software. The genetic linkage map was composed of 21 linkage groups， covering 21 chromosomes of wheat， with a total length of 5 528.12 cM and an average spacing of 5.25 cM. A total of 6 additive QTLs were detected out， which distributed on chromosome 1A， 1B， 2A， 3A， 7A and 7D with the contribution rate of 3.24%～10.37%. The results would lay a foundation for the fine mapping and cloning of QTLs associated with wheat sharp eyespot resistance， and provide basis for molecular marker assisted selection breeding in wheat.

KeywordsWheat; Genetic linkage map construction; Sharp eyespot disease; QTL mapping; 90K SNP array

小麥紋枯病又稱白穗?。╳hite head）、尖眼斑?。╯harp eyespot），主要是由禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）的第一菌絲融合群（CAG-1）以及立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的第四、五融合群（AG-4、AG-5）引起的一種土傳病害，已成為我國(guó)長(zhǎng)江流域和黃淮麥區(qū)的主要病害之一，對(duì)山東省小麥的危害已超過(guò)白粉病，由次要病害升級(jí)為主要病害。該病主要破壞小麥的莖、葉鞘等輸導(dǎo)組織和機(jī)械組織，阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，降低植株的抗倒伏能力，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)引起籽粒皺縮和白穗，一般造成減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重地塊減產(chǎn)可超過(guò)50%[1]。因此，選育和推廣抗紋枯病小麥新品種，是解決小麥紋枯病危害最直接、最有效的途徑，而抗病品種的培育得益于紋枯病抗性基因的挖掘與利用。

從遺傳學(xué)上來(lái)講，作物抗病性是由多個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait loci，QTL）控制的性狀，遺傳機(jī)理復(fù)雜。通過(guò)構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜定位抗病QTL，進(jìn)而明確其在相應(yīng)遺傳背景下的作用強(qiáng)度和作用方式，對(duì)植物抗病育種有著十分重要的意義。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在水稻、大麥、小麥、玉米等多種作物上均定位到抗病QTL[2-5]。就小麥抗紋枯病QTL而言，最早見(jiàn)于霍納新的相關(guān)報(bào)道，其利用SSR與AFLP標(biāo)記共檢測(cè)到3個(gè)成株期QTL和6個(gè)苗期QTL [6]。而后，蔡士賓等[7]用ARz×揚(yáng)麥158的RIL群體為材料，釆用單標(biāo)記方差分析法，發(fā)現(xiàn)11個(gè)SSR標(biāo)記與抗病表型顯著相關(guān)，能解釋表型變異的5.0%～13.0%。Chen等[8]用美國(guó)抗病品種Luke與國(guó)內(nèi)抗病品系A(chǔ)Q24788-83構(gòu)建RIL群體，在溫室和大田兩種環(huán)境下，共檢測(cè)到11個(gè)抗紋枯病QTL，其中7個(gè)在不同環(huán)境條件下均穩(wěn)定地表現(xiàn)抗病作用;然而該研究利用兩個(gè)抗病親本組配分離群體，在后續(xù)QTL分析過(guò)程中容易漏掉在雙親中共同表達(dá)的抗病QTL。Wu等[9]以抗病材料CI12633和感病品種揚(yáng)麥9號(hào)為親本，構(gòu)建分離群體，共鑒定到5個(gè)抗病QTL，同時(shí)發(fā)現(xiàn)小麥紋枯病抗性與抽穗期以及分蘗角度呈顯著負(fù)相關(guān)，與基部第一節(jié)間和第二節(jié)間的直徑呈顯著正相關(guān)。

雖然前人研究中已得到了一批抗性QTL，但檢測(cè)到的QTL存在連鎖圖譜密度低、QTL區(qū)段大以及有些QTL供體親本在生產(chǎn)上難以直接利用等問(wèn)題，導(dǎo)致目前還沒(méi)有抗性QTL在小麥育種中成功利用的報(bào)道。本研究以前期鑒定到的農(nóng)藝性狀優(yōu)良的抗紋枯病材料萊州953和感病材料山農(nóng)輻63為親本組配分離群體，以高通量的SNP標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜，定位控制紋枯病抗性的QTL，為小麥抗紋枯病QTL定位和基因克隆奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為小麥抗紋枯病分子標(biāo)記輔助選擇育種及種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

以農(nóng)藝性狀優(yōu)良的抗紋枯病品種萊州953為父本、高感紋枯病品種山農(nóng)輻63為母本進(jìn)行雜交，構(gòu)建含170個(gè)株系的F?2∶?3群體，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥種質(zhì)創(chuàng)新與利用團(tuán)隊(duì)創(chuàng)制并保存。

1.2田間種植及抗性鑒定

2016—2017年度將F?2∶?3分離群體及其親本種植于山東省臨沂市紋枯病鑒定圃，每個(gè)株系種植2行，2次重復(fù)，行長(zhǎng)2 m，行距0.25 m，株距3.0 cm。田間管理參照當(dāng)?shù)匾话愦筇铩?月中旬調(diào)查發(fā)病情況，病級(jí)劃分按照0～5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[10]。每重復(fù)隨機(jī)取20個(gè)莖調(diào)查紋枯病感病性，并計(jì)算平均病級(jí)。

1.3基因型分析

用植物基因組DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取親本和F?2各單株的DNA。小麥90K SNP標(biāo)記，由北京康普森生物技術(shù)有限公司利用Illumina SNPGenotyping技術(shù)測(cè)試平臺(tái)、依靠微珠芯片技術(shù)（Bead Array）進(jìn)行檢測(cè)，并利用GenomeStudio v1.0軟件進(jìn)行SNP多態(tài)性分析。

1.4構(gòu)建遺傳連鎖圖譜

篩選多態(tài)性標(biāo)記后，將分離群體基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入QTL IciMapping 4.1軟件，利用BIN程序去除冗余標(biāo)記，然后利用MAP程序構(gòu)建該群體的遺傳連鎖圖譜。

1.5QTL定位

結(jié)合連鎖圖譜與抗病表型數(shù)據(jù)，采用基于完備區(qū)間作圖法QTL IciMapping 4.1軟件的BIP程序進(jìn)行加性QTL檢測(cè)，設(shè)LOD閾值為2.5。QTL命名方法按照QTL+性狀+染色體命名，其中，QTL以Q表示，性狀以英文縮寫(xiě)表示且僅首字母大寫(xiě)（Ses）。

2結(jié)果與分析

2.1小麥遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

本研究采用的90K芯片包含81 577個(gè)SNP標(biāo)記，覆蓋小麥21條染色體。其中，在雙親間共檢測(cè)到4 378個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，利用IciMapping 4.1的BIN程序刪除冗余標(biāo)記后，共有1 052個(gè)標(biāo)記用于遺傳連鎖圖譜的繪制。該圖譜全長(zhǎng)5 528.12 cM，平均圖距5.25 cM。分布于小麥A、B和D染色體組的標(biāo)記數(shù)分別為412、530、110個(gè)，連鎖長(zhǎng)度分別為1 737.73、2 412.62、1 377.77 cM，D染色體組標(biāo)記數(shù)最少、平均圖距最長(zhǎng)。同源群中，第1同源群遺傳長(zhǎng)度最長(zhǎng)，第4同源群標(biāo)記數(shù)目最少、平均圖距最短（表1）。

2.2小麥作圖群體及其親本的紋枯病抗性分析

2016—2017年度，在紋枯病鑒定圃中，對(duì)F?2∶?3分離群體及其親本進(jìn)行田間抗性鑒定，記錄病級(jí)。結(jié)果（表2）表明，抗病親本萊州953對(duì)紋枯病抗性較強(qiáng)（平均病級(jí)為1.30），感病親本山農(nóng)輻63高感紋枯?。ㄆ骄〖?jí)為4.56），F(xiàn)?3家系的平均病級(jí)范圍為1.05～4.75，呈連續(xù)性分布，符合數(shù)量遺傳特征。

2.3小麥抗紋枯病QTL分析

利用QTL IciMapping 4.1軟件的完備區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL檢測(cè)，在LOD值>2.5水平下，共定位到6個(gè)QTL位點(diǎn)，分布于小麥的1A、1B、2A、3A、7A和7D染色體上（表3和圖1），單個(gè)QTL可解釋表型變異的3.24%～10.37%。其中，1A染色體上檢測(cè)到的QTL ?QSes1A?位于標(biāo)記IAAV3695-BS00103166_51之間，貢獻(xiàn)率大于10%，為主效QTL，其加性效應(yīng)值為-0.60，表明該QTL抗紋枯病的等位基因來(lái)自抗病親本萊州953。QTL ?QSes3A?和?QSes7D?分別定位于3A和7D染色體上，可解釋抗病表型變異分別為9.55%和9.49%，加性效應(yīng)值均為負(fù)值，表明其控制紋枯病抗性的等位基因來(lái)源于親本萊州953。另外3個(gè)QTL，?QSes1B?、?QSes2A?和?QSes7A?，貢獻(xiàn)率相對(duì)較低，且抗性等位基因來(lái)源于山農(nóng)輻63。

3討論

QTL定位結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提條件是構(gòu)建高質(zhì)量的遺傳連鎖圖譜。與傳統(tǒng)的分子標(biāo)記RFLP、AFLP、RAPD和SSR相比，SNP標(biāo)記具有數(shù)量多、分布廣、通量高等優(yōu)點(diǎn)，是目前認(rèn)可度最高的分子標(biāo)記[10]。本研究利用小麥Illumina 90K SNP芯片，檢測(cè)出雙親間具有多態(tài)性的位點(diǎn)4 378個(gè)，刪除冗余標(biāo)記后，用1 052個(gè)標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，構(gòu)建的圖譜長(zhǎng)度高于用傳統(tǒng)的分子標(biāo)記構(gòu)建的圖譜。隨著小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的完善，SNP標(biāo)記將在小麥基因定位、候選基因預(yù)測(cè)、基因克隆等方面扮演更重要的角色[11，12]。

在本圖譜1 052個(gè)標(biāo)記中，B基因組標(biāo)記數(shù)目最多、圖譜最長(zhǎng)，D基因組標(biāo)記數(shù)目最少、圖譜最短。這與張傳量等[13]以小偃81 × 周8425B和小偃81 × 西農(nóng)1376兩個(gè)組合的RIL群體構(gòu)建的圖譜趨勢(shì)一致，表明90K芯片SNP標(biāo)記在小麥染色體組A、B和D間分布不均衡。D染色體組標(biāo)記數(shù)目少，主要是因?yàn)樵谛←溸M(jìn)化過(guò)程中，D基因組加入較晚，沒(méi)有產(chǎn)生充分的基因交流，故而保守性較高[14，15]。

前人研究表明，小麥抗紋枯病QTL主要分布在1A、2B、6B和7D染色體上[6-9， 16，17]。本研究共定位到6個(gè)QTL位點(diǎn)，分別位于小麥的1A、1B、2A、3A、7A和7D染色體上。其中，僅有位于1A染色體上的?QSes1A?為主效QTL。其他QTL貢獻(xiàn)率都在10%以下，進(jìn)一步表明小麥對(duì)紋枯病的抗性是由多個(gè)微效基因共同控制的，屬于典型的數(shù)量性狀。

本研究發(fā)現(xiàn)，?QSes1B、QSes2A和QSes7A?這3個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率分別為8.70%、3.76%和3.24%，其抗性等位基因來(lái)源于感病親本山農(nóng)輻63。這種現(xiàn)象在作物抗旱性QTL定位研究中也有報(bào)道[18，19]，如在濰麥8號(hào)與濟(jì)麥20組配的RIL群體中，位于4A染色體上的兩個(gè)QTL ?QSLDWR-WJ-4A和QCLR-WJ-4A?，其抗旱增效基因來(lái)源于抗旱性差的濰麥8號(hào)，表明抗性差的材料在某些位點(diǎn)上也可能存在相應(yīng)的抗性增效基因，這也正是通過(guò)雜交聚合能夠培育抗性優(yōu)良作物新品種的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為抗病遺傳改良中雜交親本的選擇拓寬了新的思路。

4結(jié)論

本研究基于90K芯片SNP標(biāo)記，繪制了一張長(zhǎng)度5 528.12 cM、具有1 052個(gè)標(biāo)記的小麥遺傳連鎖圖譜。在此基礎(chǔ)上，定位到分布于小麥1A、1B、2A、3A、7A和7D染色體上的6個(gè)加性抗紋枯病QTL位點(diǎn)，其中來(lái)源于抗病親本萊州953、位于1A染色體的 ?QSes1A?為抗紋枯病主效QTL。本研究結(jié)果可為小麥抗紋枯病QTL精細(xì)定位、相關(guān)基因克隆以及小麥抗紋枯病遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

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