李小波 潘教文 丁國(guó)華 李臻 王慶國(guó) 劉煒

摘要：利用BCECF-AM熒光染料和激光共聚焦顯微鏡測(cè)定谷子根部細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，進(jìn)而換算成細(xì)胞內(nèi)pH值，以此來研建測(cè)定谷子根部細(xì)胞內(nèi)pH值的方法。結(jié)果顯示：正常水培條件下，谷子品種YG2和AN04根部細(xì)胞內(nèi)pH值分別為5.85±0.11和5.77±0.26;鹽處理下YG2和AN04根部細(xì)胞內(nèi)pH值分別達(dá)到6.21±0.26和6.19±0.17，即鹽敏感品種AN04根部細(xì)胞鹽處理后pH值變化較大，提高7.28%，而抗鹽品種YG2提高6.15%。這說明抗鹽品種鹽脅迫下細(xì)胞內(nèi)pH值受外界環(huán)境影響較小，對(duì)鹽害的耐受力較高。該方法用來定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)pH值具有可信性，亦可作為評(píng)價(jià)植物耐受脅迫能力的輔助手段。

關(guān)鍵詞：谷子;鹽脅迫;BCECF-AM熒光染料;根部細(xì)胞內(nèi)pH值

中圖分類號(hào)：S516.01文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）02-0040-05

Determination of pH Value in Root Cells of

Foxtail Millet under Salt Stress

Li Xiaobo1，?Pan Jiaowen??Ding Guohua??Li Zhen??Wang Qingguo??Liu Wei1，3

（1.Biotechnology Research Center， Shandong Acadamy of Agricultural Sciences/Shandong

Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement， Ecology and Physiology， Jinan 250100， China;

2. School of Life Sciences and Technology， Harbin Normal University， Harbin 150025， China;

3.College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China）

AbstractThe fluorescent probe of BCECF-AM was used to measure the intracellular pH value in root cells of foxtail millet in this research. The fluorescence intensity was detected with laser scanning confocal microscopy， and then was converted to pH value. The results showed that the pH values in root cells of the foxtail millet varieties YG2 and AN04 were 5.85±0.11 and 5.77±0.26 respectively under normal hydroponic culture， but increased to 6.21±0.26 and 6.19±0.17 respectively under salt treatment. The pH value ofsalt-sensitive variety AN04 increased by 7.2%， which was a little more than that of salt-resistant variety YG2 of 6.15% under salt stress. The results indicated that the intracellular pH value of salt-tolerant varieties was less affected by external environment， and their tolerance to salt damage was higher. This method was reliable for the quantitative determination of intracellular pH value， and it could be used as an auxiliary means to evaluate the tolerance of plants to stress.

KeywordsFoxtail milliet （Setaria italic L.）; Salt stress; BCECF-AM fluorescent dye; Intracellular pH value in root

土壤鹽漬化是目前影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的主要環(huán)境因子之一，也是全球面臨的重大危機(jī)之一[1]。鹽漬化土壤中，高濃度的鹽會(huì)引起植物的離子脅迫、滲透脅迫及氧化脅迫[2]，導(dǎo)致植物體內(nèi)正常的離子分布和動(dòng)態(tài)平衡被打亂，從而破壞細(xì)胞內(nèi)的各種代謝活動(dòng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧積累，細(xì)胞膜過氧化、生物大分子破壞，最終傷害植物生長(zhǎng)代謝，甚至引起植物死亡[3，4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)鹽堿地面積約為9 913×104 hm?占全球鹽堿地總面積近10%[5]。鹽堿地作為我國(guó)重要的后備土地資源，因其土壤質(zhì)量差、生產(chǎn)效率低而大面積荒蕪，導(dǎo)致這些地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不足，嚴(yán)重制約其區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展[6]。因此研究作物耐鹽機(jī)制、培育抗逆耐鹽作物新品種，是農(nóng)業(yè)科學(xué)家的重大責(zé)任。

近年來，對(duì)植物應(yīng)答鹽脅迫的生理生化研究，尤其是在分子生物學(xué)層面的研究成果，使植物響應(yīng)鹽脅迫及植物的耐鹽機(jī)制越來越清晰。但是對(duì)植物細(xì)胞如何參與鹽脅迫及鹽脅迫下細(xì)胞內(nèi)pH值的變化研究較少。已知細(xì)胞內(nèi)的pH值在許多細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，是控制植物細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因素之一[7]。細(xì)胞內(nèi)pH值通常為中性，而液泡的pH值通常在5.0～6.5之間。細(xì)胞內(nèi)pH值參與調(diào)節(jié)酶活性、代謝途徑和生理活動(dòng)等，因此細(xì)胞內(nèi)pH值測(cè)定可以為植物抗逆等方面研究提供重要參考依據(jù)。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)pH值測(cè)定方法常用的有核磁共振法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）、微電極法（microelectrodes）、熒光染料法（fluorescent dyes）、細(xì)胞液提取法 （cell sap extract）和弱酸弱堿分布法（weak acid and base distribution）等[8]。其中熒光染料法是采用pH值敏感熒光染料進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)pH值測(cè)定，常用熒光染料有BCECF[3′-O-acetyl-2′，7′-bis（carboxyethyl）-5-carboxyfluorescein]和SNARF（seminaphtor hodafluor）。BCECF作為一種pH熒光探針被廣泛地用于細(xì)胞內(nèi)pH值測(cè)定，但是其自身很難穿過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，而BCECF-AM[3′-O-acetyl-2′，7′-bis（carboxyethyl）-5-carboxyfluorescein， diacetoxy methyl ester]是乙酰甲酯化的BCECF，它如同其它乙酰甲酯類物質(zhì)一樣能夠輕易地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)BCECF-AM透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后，AM基團(tuán)在細(xì)胞內(nèi)酯酶的作用下被水解，形成親水且能發(fā)熒光的BCECF，而BCECF的熒光強(qiáng)度依賴于細(xì)胞內(nèi)pH值的大小。分別用490 nm和440 nm的波長(zhǎng)激發(fā)BCECF所得到的熒光強(qiáng)度比值與pH值之間存在很好的線性關(guān)系，繼而可以進(jìn)一步定量測(cè)算細(xì)胞內(nèi)pH值。

谷子（Setaria italica L.），作為我國(guó)特色雜糧作物，具有須根粗壯、根系發(fā)達(dá)和耐鹽耐旱能力較強(qiáng)等特點(diǎn)，是應(yīng)對(duì)未來水資源短缺的重要戰(zhàn)略儲(chǔ)備作物[9]。谷子因具備C4 光合途徑和特殊抗旱耐逆性而備受國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注，近年來已逐漸發(fā)展成為C4和抗旱耐逆研究的模式作物[10]。前期研究中，我們篩選到抗鹽及鹽敏感谷子品種豫谷2號(hào)（YG2）和安04（AN04）。本研究，我們以這兩種材料為基礎(chǔ)，采用BCECF-AM熒光探針標(biāo)記方法測(cè)定150 mmol/L NaCl鹽脅迫引起的谷子根部細(xì)胞內(nèi)pH值變化，且為了讓BCECF-AM更加快速地透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)選擇高分子非離子型表面活性劑泊洛沙姆（Pluronic F-127）來增加BCECF-AM的水溶性，提高其透過細(xì)胞膜的效率。通過該研究以明確利用熒光探針標(biāo)記法定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)pH值的可靠性，繼而作為評(píng)價(jià)植物耐受脅迫能力的輔助手段用于抗性品種的篩選及培育。

1材料與方法

1.1材料與試劑

所用谷子品種為豫谷1號(hào)（YG1）、豫谷2號(hào)（YG2）和安04（AN04）。將種子排放入培養(yǎng)皿，放到人工氣候培養(yǎng)箱中，于28℃、光周期（光照/黑暗）8 h/16 h條件下萌發(fā)培養(yǎng)4 d備用。

所用試劑BCECF-AM、Pluronic F-127購(gòu)于英杰生命技術(shù)有限公司;MES（2-嗎啉乙磺酸）購(gòu)于賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司;HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）購(gòu)于北京酷來搏科技有限公司;MS、NaCl、蔗糖、醋酸銨、KOH購(gòu)于上海瀘試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司。

pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）平衡緩沖液配制如表1所示，加入相應(yīng)試劑后用KOH調(diào)至相應(yīng)pH值，并定容至50 mL。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1pH值標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制挑選7組YG1幼苗，每組20株，將其放在含有10 μmol/L BCECF-AM 和0.02% Pluronic F-127的1/10 MS液體培養(yǎng)基中，于22℃、黑暗中溫育2 h，然后在不同pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）平衡緩沖液中平衡15 min，以校正幼苗根部細(xì)胞內(nèi)pH值。之后洗滌兩次，用激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照。即：分別對(duì)根部根尖細(xì)胞、伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞和下胚軸細(xì)胞進(jìn)行觀察，用488 nm和ECFP nm熒光激發(fā)后，收集熒光圖像;圖像經(jīng)校正后測(cè)定488 nm和ECFP nm激發(fā)圖像的熒光強(qiáng)度，并利用ImageJ1.44軟件計(jì)算比值ratio488/ECFP。通過不同pH值下的熒光強(qiáng)度比值繪制pH值標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2細(xì)胞內(nèi)pH值的檢測(cè)以抗鹽及鹽敏感谷子品種YG2和AN04為試材。將YG2和AN04幼苗置于含有無菌水的培養(yǎng)皿中，于28℃、光周期（光照/黑暗）8 h/16 h條件下人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。之后處理組用150 mmol/L NaCl處理12 h，再將處理組（NT）和對(duì)照組（CK）分別置于含有10 μmol/L BCECF-AM和0.02% Pluronic F-127的1/10 MS液體培養(yǎng)基中，于22℃、黑暗中溫育2 h，再用MS培養(yǎng)基清洗兩次，而后用488 nm和ECFP nm熒光激發(fā)后，收集熒光圖像。利用ImageJ1.44軟件計(jì)算兩個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)下圖像的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算兩者比值ratio488/ECFP，再與pH值標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算得到不同比值對(duì)應(yīng)的pH值。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用WPS Office 11.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1pH值標(biāo)準(zhǔn)曲線

激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)時(shí)，選擇兩個(gè)熒光通道，分別是綠色熒光488 nm通道和藍(lán)色熒光ECFP通道（ECFP約475～503 nm），最終得到兩激發(fā)波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度比值ratio488/ECFP。利用激光共聚焦顯微鏡測(cè)定不同pH值緩沖液下YG1根部細(xì)胞中的BCECF熒光強(qiáng)度，并通過ImageJ1.44軟件分析并計(jì)算得到不同pH值下的ratio488/ECFP，結(jié)果如圖1所示。pH值與BCECF熒光強(qiáng)度比值 ratio488/ECFP之間呈良好的線性關(guān)系，其R2=0.9927，回歸方程為Y=2.4581X-10.6360，式中Y為熒光強(qiáng)度比值 ratio488/ECFP，X為 pH 值?？梢钥闯觯S著谷子根部細(xì)胞內(nèi)pH值的升高，綠色熒光通道488 nm和藍(lán)色熒光通道ECFP的熒光強(qiáng)度比值也隨之升高，兩者呈正相關(guān)。

2.2YG2和AN04鹽處理前后根細(xì)胞內(nèi)pH值的變化

利用激光共聚焦顯微鏡測(cè)定YG2和AN04谷子幼苗根部細(xì)胞在正常水培條件下和150 mmol/L NaCl脅迫下的熒光強(qiáng)度（其掃描圖見圖2），并計(jì)算得到比值ratio488/ECFP。將該比值代入到pH值標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，得到對(duì)照和鹽處理下YG2和AN04根部細(xì)胞內(nèi)的pH值。從圖3看出，對(duì)照組根部細(xì)胞內(nèi)pH值明顯低于鹽處理組，其中AN04對(duì)照組的pH值為5.77±0.26，鹽處理組為6.19±0.17，鹽處理組比對(duì)照提高7.28%;YG2對(duì)照組根部細(xì)胞內(nèi)pH值為5.85±0.11，鹽處理組為6.21±0.26，鹽處理組比對(duì)照提高6.15%。說明鹽敏感品種AN04的根部細(xì)胞，在鹽處理下的pH值變化較大，比YG2高1.13個(gè)百分點(diǎn)。由此可見，抗鹽品種YG2在鹽脅迫下，細(xì)胞內(nèi)pH值受外界環(huán)境影響較小，對(duì)鹽害的耐受力較高。

3討論與結(jié)論

迄今為止，利用熒光染料技術(shù)研究植物細(xì)胞內(nèi)pH值的報(bào)道較少。其中姜淑媛等（2009）[11]在研究茶樹熒光性綠斑病時(shí)發(fā)現(xiàn)，在含BCECF的茶樹葉中，正常葉片胞內(nèi)pH值為5.35，病害葉片胞內(nèi)pH值為6.89，病害葉片胞內(nèi)pH值與病害程度呈顯著正相關(guān)。Krebs等（2010）[12]為了研究擬南芥液泡ATP酶活性，測(cè)定了野生型和VHA-A3單突變體擬南芥根細(xì)胞內(nèi)的pH值，發(fā)現(xiàn)野生型的為5.9，而突變體的為6.4，液泡膜ATP的丟失使根表皮細(xì)胞液泡pH值增加0.5個(gè)pH單位。Bassil等（2011）[13]為了研究細(xì)胞內(nèi)Na+/H+ 反轉(zhuǎn)運(yùn)體在細(xì)胞pH值和Na+、K+穩(wěn)態(tài)中的作用，測(cè)定了擬南芥根細(xì)胞的pH值，發(fā)現(xiàn)根成熟區(qū)和下胚軸細(xì)胞中nhx1、nhx2缺失型植株的液泡pH值較野生型分別降低0.50個(gè)和0.35個(gè)pH值單位。

本研究中，我們選用YG1來制作pH值標(biāo)準(zhǔn)曲線。YG1基因組序列已測(cè)序并釋放，也是我國(guó)育成的優(yōu)良品種，國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究較深入，以該材料制作的pH值標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較高參考價(jià)值。通過對(duì)鹽脅迫下谷子YG2和AN04根部細(xì)胞內(nèi)的熒光圖像及pH值的分析表明，谷子經(jīng)鹽處理后，兩品種根部細(xì)胞內(nèi)pH值均升高。鑒于pH調(diào)控系統(tǒng)是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的一種抗逆機(jī)制，故認(rèn)為本研究中谷子根部細(xì)胞內(nèi)pH值的上調(diào)，是其對(duì)鹽脅迫的一種應(yīng)答響應(yīng)，是其在遭受鹽害時(shí)降低離子吸收以減輕離子毒害的應(yīng)激反應(yīng)。鹽脅迫前后細(xì)胞內(nèi)pH值的變化大小及pH值調(diào)控系統(tǒng)效率高低客觀上反映出植物在進(jìn)化過程中抵抗逆境脅迫能力的強(qiáng)弱。本研究中通過對(duì)鹽脅迫下抗鹽谷子品種YG2和鹽敏感品種AN04根部細(xì)胞內(nèi)pH值的變化進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫處理后兩個(gè)谷子品種根部細(xì)胞內(nèi)pH值均升高，且抗鹽品種YG2升高幅度較鹽敏感品種AN04小。這也與鹽脅迫處理前后細(xì)胞內(nèi)pH值的變化大小反映出植物抵抗逆境脅迫能力強(qiáng)弱這一理論一致，證實(shí)了該測(cè)定方法的可靠性。因此該方法可以作為評(píng)價(jià)植物耐受鹽脅迫能力的輔助手段。

總之，利用BCECF熒光染料方法測(cè)定植物根系細(xì)胞內(nèi)pH值，優(yōu)點(diǎn)在于操作相對(duì)簡(jiǎn)單，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH值變化，適用于各種不同大小的細(xì)胞，重復(fù)性較好，可以同時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)的pH值[8]。這一方法為今后研究植物在各種脅迫條件下細(xì)胞內(nèi)pH值的變化提供了一條有效途徑。應(yīng)用該方法，本試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)首次研究了鹽脅迫對(duì)谷子根系細(xì)胞內(nèi)pH值的影響，顯示鹽脅迫處理后根系細(xì)胞內(nèi)pH值明顯升高，并且抗鹽品種較鹽敏感品種變化小，說明抗鹽品種在應(yīng)對(duì)鹽脅迫過程中其胞內(nèi)環(huán)境更加穩(wěn)定。這為進(jìn)一步研究鹽脅迫與植物細(xì)胞內(nèi)pH值變化間的關(guān)系奠定了一定基礎(chǔ)。

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