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        高速逆流色譜結(jié)合半制備型液相色譜分離茶樹紫芽花色苷研究

        2019-04-06 11:56:26劉林峰肖文軍龔志華
        茶葉通訊 2019年2期
        關(guān)鍵詞:逆流花色純度

        張 拓,劉林峰,林 玲,周 陽(yáng),肖文軍,2,龔志華*

        (1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南 長(zhǎng)沙 410128)

        花色苷是一類具有2-苯基苯并吡喃基本母核結(jié)構(gòu)的植物次生代謝產(chǎn)物,具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、提高免疫、清除自由基、抗氧化等多種生物活性[1-4],是近年天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)利用領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。茶樹芽葉出現(xiàn)紫化主要是由茶樹種質(zhì)、發(fā)育特性及其生長(zhǎng)環(huán)境條件等因素所引起的花色苷含量顯著增加的抗逆生理表現(xiàn)。在傳統(tǒng)茶葉加工中,由于以紫色芽葉加工而成的茶產(chǎn)品在干茶色澤、湯色及葉底等品質(zhì)因子上呈紫色,被認(rèn)為不適于茶葉加工而造成大量浪費(fèi)。隨著紫芽茶樹花色苷研究的深入以及健康意識(shí)的增強(qiáng),茶葉花色苷的高值化利用越來(lái)越受到業(yè)界的關(guān)注。然而,由于茶葉原料中花色苷含量較低,且存在多種花色苷組分,從而使得制備高純度的花色苷及其組分難度較大。目前分離純化植物花色苷的技術(shù)方法主要有柱層析法、高速逆流色譜法、半制備型高效液相色譜法和反相高效液相色譜法等,如申芮萌等[5]采用葡聚糖Sephadex LH-20凝膠層析柱分離純化藍(lán)莓中的花色苷,并優(yōu)化了分離花色苷的最佳緩沖液濃度、流速以及上樣量等條件;曹少謙等[6]采用柱層析法分離純化血橙中的花色苷,篩選出最佳的大孔樹脂,同時(shí)對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化;于澤源等[7]采用大孔樹脂-中壓柱層析分離純化藍(lán)莓花色苷,其純度為90.88%;劉雪輝等[8]、陸英等[9]利用高速逆流色譜技術(shù)研究了玫瑰茄和紫甘薯中的花色苷分離純化工藝,并對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化;SAITO T[10]采用色譜法研究紅芽茶樹中花色苷的分離工藝;以及以半制備型高效液相色譜法和反相高效液相色譜技術(shù)來(lái)分離純化花色苷[11],但大多研究局限單一技術(shù)方法分離純化花色苷,結(jié)合不同分離技術(shù)的方法分離純化茶葉花色苷及其組分的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以茶樹紫色芽葉為材料,經(jīng)酸性乙醇避光浸提、萃取脫脂、陽(yáng)離子交換樹脂吸附等初步分離,探究了高速逆流色譜結(jié)合半制備型液相色譜制備高純茶葉花色苷組分的工藝技術(shù),以期為茶樹紫色芽葉及其花色苷的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

        1 材料和方法

        1.1 茶葉與試劑

        茶樹鮮葉:采摘湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長(zhǎng)安實(shí)踐教學(xué)基地高花色苷茶樹品系自選9803的一芽二葉茶鮮葉,經(jīng)冷凍干燥、粉碎后得茶葉粉末,低溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

        藥品試劑:乙腈、甲醇(色譜純)、甲醇、無(wú)水乙醇(分析純)、天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;正己烷、乙酸乙酯(分析純)、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑制造有限公司;矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷:北京譜析科技有限公司;飛燕草素-葡萄糖苷:西寶生物科技(上海)股份有限公司;超純水:自制;酸性乙醇水溶液:自制;鈉型732陽(yáng)離子交換樹脂:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑制造有限公司。

        1.2 儀器設(shè)備

        超聲波清洗器,KQ2200B型,昆山超聲儀器有限公司;冷凍干燥機(jī),MODULYOD-230型,Thermo Fisher Sciebti fic,美國(guó);色譜分析柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),C18 ECOSIL HPLC COLUMN型,日本ECOSIL公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),UV754N型,德國(guó)Thermo Scienti fic公司;SPD-20A型紫外檢測(cè)器;Unitary C18反相色譜柱 (10 mm×250 mm,5 μm);高效液相色譜儀,A20型,日本Shimazu公司;精密電子天平,AE240型,瑞士Starorius公司;pH計(jì),瑞士梅特勒-托利多公司;超低溫冰箱,美國(guó)Thermo公司;水浴鍋,DSY-2-8型,北京國(guó)華醫(yī)療器械廠;高速逆流色譜(內(nèi)徑1.6 mm,容積 280 mL,轉(zhuǎn)速 0~1000 r/min),TBE-300A 聚四氟乙烯柱,上海同田公司;制備型高效液相色譜儀,LC-8A 型,日本Shimadzu Corporation公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,SY-2000型,上海榮亞生化儀器廠。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 茶樹紫芽花色苷的提取

        取茶樣干粉21.96 g,花色苷提取條件參考文獻(xiàn)[12-14],設(shè)置為:料液體積比1∶25、80%乙醇(加1%冰醋酸)、室溫避光浸提24 h、提取兩次,合并兩次浸提液,蒸發(fā)濃縮至膏狀后獲得提取物保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.2 脫脂

        取茶樣干粉13.60 g,配置正己烷∶乙酸乙酯∶水混合溶劑(1∶1∶2,V/V/V),對(duì)茶樣提取液進(jìn)行萃取脫脂處理,萃取至有機(jī)層無(wú)色為止,收集脫脂液,低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.3 離子交換樹脂分離

        以1.3.2得到的脫脂液為上樣液,經(jīng)鈉型732陽(yáng)離子交換樹脂[15-16]吸附,樹脂前處理方法參照馬淑青等[15],上樣液pH 值為3、上樣液流速為5 BV/h[17-18],吸附至飽和為止;吸附完成后分兩次洗脫, 第一次洗脫:采用80%乙醇溶液洗脫,洗脫液流速3 BV/h,洗脫液合并收集10 BV濃縮至1 BV去有機(jī)相,得到濃縮液I,HPLC檢測(cè)分析濃縮液I的濃度;第二次洗脫:依次采用2 BV不同比率4%鹽酸-乙醇溶液洗脫,洗脫液流速3 BV/h,洗脫梯度為50%、60%、70%、80%、90%,按乙醇濃度分別收集洗脫液,2 BV合并濃縮至1 BV去有機(jī)相,得濃縮液Ⅱ,HPLC檢測(cè)分析濃縮液Ⅱ的濃度。

        1.3.4 大孔樹脂除酸

        離子交換樹脂的第二次洗脫液濃縮后經(jīng)D101大孔樹脂吸附樹脂去除鹽酸,濃縮收集液、冷凍干燥得到紫芽茶樹花色苷粗品粉末,粉末用甲醇溶解,HPLC檢測(cè)并計(jì)算粗品總花色苷純度(參照1.3.7)。

        1.3.5 高速逆流色譜溶劑體系篩選與分離

        按表1設(shè)計(jì)不同溶劑體系方案,按比例配置10 mL體系溶液。振蕩混勻后待靜置分層,移取3 mL下相加入少量上述花色苷粉末,再用3 mL上相萃取,分別檢測(cè)萃取前后花色苷組分的峰面積,各組分的分配系數(shù)(K值)計(jì)算方法參考文獻(xiàn)陳田等[19],篩選最佳溶劑體系。

        選取表1中最佳溶劑體系方案,高速逆流色譜分離參數(shù)參考文獻(xiàn)[8,19]:將最佳溶劑體系靜置12 h,兩相分離后超聲脫氣30 min。上相作固定相,下相作流動(dòng)相,將固定相以20 mL/min的流速泵滿管路,然后以850 r/min正轉(zhuǎn),流速2 mL/min的條件泵入流動(dòng)相,溫度25℃,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。取20 mL下相溶解花色苷500 mg,進(jìn)樣20 mL后采集數(shù)據(jù)。根據(jù)高速逆流色譜峰峰型、保留率P和流出液情況判斷分離效果。根據(jù)色譜分步收集 110~130 min、138~159 min、251~271 min、280~299 min 時(shí)的流出物,合并相同化合物的流出液,減壓濃縮溫度為40℃,冷凍干燥備用。取少量干粉甲醇溶解,經(jīng)HPLC進(jìn)樣檢測(cè)。

        1.3.6 半制備高效液相色譜制備花色苷及其組分的條件優(yōu)化

        表1 不同溶劑體系設(shè)計(jì)方案Table 1 Designs of Different solvent systems

        將高速逆流色譜法得到干粉用甲醇溶解,參考上述高效液相色譜條件,采用C18制備柱(20 mm×250 mm,10 μm),在波長(zhǎng) 280 nm、柱溫30℃的條件下,控制其他條件不變,分別探究不同流動(dòng)相、不同流速、不同進(jìn)樣量、不同梯度洗脫方案對(duì)花色苷分離效果的影響[20],方案設(shè)計(jì)如表2,確定最佳色譜條件,根據(jù)色譜圖分別收集不同組分,各組分收集濃縮后做二次進(jìn)樣分離。

        表2 不同條件方案Table 2 Designs of Different condition scheme

        1.3.7 花色苷含量分析方法

        待檢測(cè)樣品液經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)膜,高效液相色譜分析方法參照劉林峰等[21],每次進(jìn)樣10 μL,重復(fù)進(jìn)樣3次,按以下公式[7,22]計(jì)算樣品液中花色苷含量。

        式中:c為花色苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg / mL);m0為花色苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量(g);v0為標(biāo)準(zhǔn)品體積(mL);A1為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積;A0為花色苷峰面積;ω為總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)(μg / g);A3為花色苷峰面積;v1為待測(cè)樣品體積(mL);m1為待測(cè)樣品質(zhì)量(g);P 為花色苷得率(mg / g);m2為總花色苷質(zhì)量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 萃取、脫脂、離子交換柱色譜與大孔樹脂分離對(duì)花色苷得率的影響

        萃取結(jié)果和離子色譜分離結(jié)果如表3。樣品粗提的條件為避光,提取后得率5.64 mg/g;再經(jīng)過(guò)有機(jī)相萃取脫脂處理、陽(yáng)離子交換樹脂層析后,得率提升;對(duì)樹脂層析處理后的花色苷分析檢測(cè),其純度為20.38%,說(shuō)明其中含有較多的雜質(zhì)。

        表3 前處理工藝結(jié)果Table 3 Result of pretreatment processes

        2.2 高速逆流色譜最佳溶劑體系的篩選

        目標(biāo)組分在兩相溶劑體系中的分配系數(shù)K值[8]影響高速逆流色譜法的分離效果,K值偏大則出峰耗時(shí)過(guò)長(zhǎng),目標(biāo)組分峰型變寬變矮,組分之間的分離度R較差;而K值偏小,各組分在固定相中的保留時(shí)間較短,出峰過(guò)快,導(dǎo)致流出組分難以分離。不同配比的溶劑體系的K值如表4所示,組別1、2、3、6中單個(gè)組分K值較大,組別4、5組分之間的K值相差較小,組分不能完全分離,篩選后確定組別7為最佳溶劑體系。

        表4 不同溶劑體系的K值及分離度R值Table 4 K value and resolution R value in different solvent systems

        在以乙酸乙酯-正丁醇-乙腈-0.1%三氟乙酸水(8∶35∶13∶60)為最佳的溶劑體系中,雜質(zhì)峰與目標(biāo)組分峰分離效果良好,保留率為56.8%,各組分在固定相中保留時(shí)間較長(zhǎng),可有效分離。收集流出液,經(jīng)檢測(cè)計(jì)算,以樹脂吸附處理后的花色苷濃縮物為樣品,經(jīng)高速逆流色譜分離后,總花色苷得率達(dá)到160.59 mg/g。以高效液相色譜檢測(cè)流出液,得到物Ⅰ和Ⅱ,物質(zhì)Ⅰ主要是黃酮類物質(zhì),而物質(zhì)Ⅱ主要是花色苷類物質(zhì),總花色苷純度達(dá)到43.64%,將交換樹脂層析后的粗品純度提高一倍左右,由此可見(jiàn),通過(guò)高速逆流色譜法可以分離出花色苷粗制品中黃酮類雜質(zhì),并有效提高花色苷粗制品純度,適用于花色苷的純化工藝。

        2.3 半制備型高效液相色譜法條件優(yōu)化

        2.3.1 梯度洗脫篩選

        通過(guò)調(diào)節(jié)各梯度的兩相組成、梯度的變化速率,從而影響目標(biāo)組分的分離效果??刂屏鲃?dòng)相為Ⅱ、流速為10 mL/min、進(jìn)樣量為1 mL,考察梯度洗脫方案的結(jié)果如圖1所示,方案a出峰時(shí)間較晚,耗時(shí)較長(zhǎng);方案b、c出峰時(shí)間均提前,方案c出峰最早。相比于方案b的分離效果,方案c可實(shí)現(xiàn)各花色苷組分的有效分離,且實(shí)驗(yàn)消耗的流動(dòng)相最少,故選擇方案c用于后續(xù)研究。

        2.3.2 洗脫流速篩選

        在半制備高效液相色譜制備花色苷及組分過(guò)程中,流速會(huì)影響溶質(zhì)、色譜柱和流動(dòng)相之間的相互作用,進(jìn)而導(dǎo)致目標(biāo)組分保留時(shí)間的變化。一般來(lái)說(shuō),隨著流速的持續(xù)增加,色譜分辨率有降低的趨勢(shì),而且過(guò)高的流速對(duì)于制備柱壽命的負(fù)面影響較大??刂屏鲃?dòng)相為Ⅱ、梯度洗脫方案為c、進(jìn)樣量為1 mL,考察流速方案的結(jié)果如圖2所示,流速?gòu)? mL/min增加到10 mL/min,出峰時(shí)間提前,耗時(shí)減?。浑S流速增大至20 mL/min,出峰時(shí)間進(jìn)一步提前,但分離度明顯下降,峰型變差,無(wú)法有效達(dá)到分離的目的,綜合后選擇5 mL/min的低流速作為較優(yōu)的洗脫流速方案。

        圖1 不同洗脫程序方案分離花色苷的HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC Chromatograms of different elution procedure

        圖2 不同洗脫流速分離花色苷的HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC Chromatograms of different elution fl ow rate

        2.3.3 進(jìn)樣量篩選

        適當(dāng)增加單次進(jìn)樣量的優(yōu)點(diǎn)在于節(jié)約時(shí)間,減少流動(dòng)相消耗,但進(jìn)樣量過(guò)大,會(huì)出現(xiàn)柱壓過(guò)載、分離度下降的問(wèn)題??刂铺荻认疵摲桨笧閏、流動(dòng)相為Ⅱ、流速為5 mL/min,考察進(jìn)樣量的結(jié)果如圖3所示,進(jìn)樣量為0.5 mL時(shí),分離效果較差,而進(jìn)樣量為2 mL時(shí),出峰時(shí)間較晚,且分離度不如1 mL進(jìn)樣量時(shí)的分離效果,故選擇1 mL為最優(yōu)進(jìn)樣量方案。

        2.3.4 流動(dòng)相篩選

        控制梯度洗脫方案為c、流速為5 mL/min、進(jìn)樣量為1 mL,以甲醇為有機(jī)相的方案Ⅰ不能將花色苷組分有效分離,方案Ⅱ出峰較早,且分離效果優(yōu)于方案Ⅰ,而方案Ⅲ出峰時(shí)間雖較晚,但分離度較方案Ⅱ高,在保證分離度的前提下,綜合三個(gè)方案,最終選擇方案Ⅲ為最優(yōu)流動(dòng)相。

        2.3.5 花色苷組分的制備

        將高速逆流色譜純化后的花色苷在甲醇中溶解,按上述篩選獲得的最優(yōu)色譜條件:C18柱(20×250 mm,10 μm)制備柱,波長(zhǎng) 280 nm,流動(dòng)相1%醋酸(A)-乙腈(B)、梯度洗脫(0~55 min,10%A~40%B),流速 5 m L/min,進(jìn)樣量為1 mL進(jìn)樣分離,根據(jù)出峰時(shí)間和峰形接收花色苷組分,各組分再濃縮二次進(jìn)樣分離。

        圖3 不同進(jìn)樣量方案分離花色苷的HPLC色譜圖Fig. 3 HPLC Chromatograms of different injection volume

        圖4 制備型HPLC第二次分離花色苷組分的HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatogram ofAnthocyanin components

        二次進(jìn)樣分離收取了5種花色苷組分流出液,各花色苷組分經(jīng)分析型HPLC進(jìn)樣檢測(cè)(圖4),花色苷組分保留時(shí)間分別為14.8 min、23.1 min、28.4 min、31.3 min 和 33.6 min,純度分別達(dá)到40.68%,24.38%,35.75%,90.61%和60.53%,其中組分4純度最高。UV光譜圖顯示(圖5)組分1、組分2、組分3、組分 4和組分 5分別在 523 nm、482 nm、534 nm、532 nm和520 nm處有最大吸收峰,而這5種組分在波長(zhǎng)280 nm附近也存在最大吸收峰,符合花色苷類物質(zhì)在可見(jiàn)光區(qū)500-540 nm附近和紫外光區(qū)280 nm附近存在最大吸收波長(zhǎng)的特征[5,9,23],同時(shí)組分2在326 nm處存在一個(gè)吸收峰,研究發(fā)現(xiàn)[24,25]花青素分子在326-329 nm處存在的吸收峰是由于咖啡酸酯化的原因,故推測(cè)組分2為酰基化花色苷。

        圖5 制備型HPLC第二次分離花色苷組分的UV光譜圖Fig. 5 UV spectrum of Anthocyanin components

        3 結(jié)論與討論

        植物中花色苷本身的含量較低,而又因植物的種類不同,其含量存在差異,在茶樹中也是如此。已有研究表明[26-27],茶樹中含飛燕草素-3-O-β-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-β-半乳糖苷、天竺葵素-3-蕓香糖苷等多種花色苷組分,而各種組分分子量、糖苷位置等不同,所以花色苷組分的功能及分子極性也會(huì)相應(yīng)地表現(xiàn)出差異,單一的分離技術(shù)可制備較高純度的花色苷,但可能會(huì)因提取條件的限制而存在花色苷變質(zhì)[12,28]、種類單一等問(wèn)題,多種色譜方法結(jié)合并分離植物活成分性的研究也有報(bào)道[29],因此,從植物中制備花色苷需要協(xié)同多種分離技術(shù),可以克服因植物原料中花色苷含量低、花色苷組分類型多、極性不同等造成制備花色苷的技術(shù)缺點(diǎn),從而達(dá)到高效分離純化植物中花色苷的目的。

        本研究采用花色苷含量較高的紫芽茶樹品種,對(duì)樣品進(jìn)行前處理,整個(gè)過(guò)程在避光、酸性條件下進(jìn)行,獲得花色苷的提取物,后續(xù)制備的濃縮液也及時(shí)冷凍干燥保存,保證在最初的原料及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,減少花色苷因變質(zhì)的失損量,盡可能多的保留樣品中的花色苷。進(jìn)而以高速逆流色譜繼續(xù)純化花色苷,在該環(huán)節(jié)中,溶劑體系的優(yōu)化極為重要,其決定了花色苷產(chǎn)物的最終得率。在本研究中,酸乙醇粗提物中得率僅為5.64 mg/g,但已高于文獻(xiàn)報(bào)道的3.78 mg/g[12],而經(jīng)過(guò)進(jìn)一步處理,并以篩選出最佳的溶劑體系進(jìn)行高速逆流色譜純化除雜,得率達(dá)到160.59 mg/g,而純度也由前處理的20.38%上升至43.64%,花色苷提取效率極大提升。最后采用半制備液相色譜,利用其分離純度高、可制備量大、分離效率高等[20,30]等優(yōu)點(diǎn),分離高純度的花色苷組分,通過(guò)優(yōu)化的色譜條件,實(shí)驗(yàn)分離出5種花色苷組分,純度最高達(dá)90%以上,說(shuō)明半制備液相色譜對(duì)于紫芽茶花色苷的分離效率與采用的色譜條件具有重要的關(guān)系。綜上所述,采用高速逆流色譜耦合半制備型液相色譜,分離純化紫芽茶樹花色苷的效率得到大幅提升,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在對(duì)紫芽茶樹花色苷及組分的分離中,高速逆流色譜結(jié)合半制備液相色譜是一種有效的分離制備花色苷的方法。

        實(shí)驗(yàn)所分離的花色苷組分中純度有高于90%的組分,但也有組分因?yàn)榉蛛x條件的限制而僅有20%以上,這樣的純度尚且達(dá)不到質(zhì)譜鑒定的要求,其中組分2,根據(jù)文獻(xiàn)可推測(cè)其為?;ㄉ眨@也需要對(duì)該組分深入的研究及分析,所以在花色苷分離純化的后續(xù)研究中,還是要以分離純化為基礎(chǔ),制備純度更高的花色苷及其組分,協(xié)同多種工藝技術(shù)、把控關(guān)鍵環(huán)節(jié)及節(jié)點(diǎn),深入分析在不同植物中花色苷類型、組分的存在方式及功能的差異性,從而真正達(dá)到制備高純度花色苷的目的,發(fā)揮植物功能成分研究開(kāi)發(fā)與利用的價(jià)值。

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