張 拓，劉林峰，林 玲，周 陽，肖文軍,2，龔志華＊

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128）

花色苷是一類具有2-苯基苯并吡喃基本母核結(jié)構(gòu)的植物次生代謝產(chǎn)物，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、提高免疫、清除自由基、抗氧化等多種生物活性[1-4]，是近年天然產(chǎn)物開發(fā)利用領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。茶樹芽葉出現(xiàn)紫化主要是由茶樹種質(zhì)、發(fā)育特性及其生長環(huán)境條件等因素所引起的花色苷含量顯著增加的抗逆生理表現(xiàn)。在傳統(tǒng)茶葉加工中，由于以紫色芽葉加工而成的茶產(chǎn)品在干茶色澤、湯色及葉底等品質(zhì)因子上呈紫色，被認(rèn)為不適于茶葉加工而造成大量浪費(fèi)。隨著紫芽茶樹花色苷研究的深入以及健康意識(shí)的增強(qiáng)，茶葉花色苷的高值化利用越來越受到業(yè)界的關(guān)注。然而，由于茶葉原料中花色苷含量較低，且存在多種花色苷組分，從而使得制備高純度的花色苷及其組分難度較大。目前分離純化植物花色苷的技術(shù)方法主要有柱層析法、高速逆流色譜法、半制備型高效液相色譜法和反相高效液相色譜法等，如申芮萌等[5]采用葡聚糖Sephadex LH-20凝膠層析柱分離純化藍(lán)莓中的花色苷，并優(yōu)化了分離花色苷的最佳緩沖液濃度、流速以及上樣量等條件；曹少謙等[6]采用柱層析法分離純化血橙中的花色苷，篩選出最佳的大孔樹脂，同時(shí)對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化；于澤源等[7]采用大孔樹脂-中壓柱層析分離純化藍(lán)莓花色苷，其純度為90.88%；劉雪輝等[8]、陸英等[9]利用高速逆流色譜技術(shù)研究了玫瑰茄和紫甘薯中的花色苷分離純化工藝，并對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化；SAITO T[10]采用色譜法研究紅芽茶樹中花色苷的分離工藝；以及以半制備型高效液相色譜法和反相高效液相色譜技術(shù)來分離純化花色苷[11]，但大多研究局限單一技術(shù)方法分離純化花色苷，結(jié)合不同分離技術(shù)的方法分離純化茶葉花色苷及其組分的研究鮮見報(bào)道。本研究以茶樹紫色芽葉為材料，經(jīng)酸性乙醇避光浸提、萃取脫脂、陽離子交換樹脂吸附等初步分離，探究了高速逆流色譜結(jié)合半制備型液相色譜制備高純茶葉花色苷組分的工藝技術(shù)，以期為茶樹紫色芽葉及其花色苷的開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 茶葉與試劑

茶樹鮮葉：采摘湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長安實(shí)踐教學(xué)基地高花色苷茶樹品系自選9803的一芽二葉茶鮮葉，經(jīng)冷凍干燥、粉碎后得茶葉粉末，低溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

藥品試劑：乙腈、甲醇（色譜純）、甲醇、無水乙醇（分析純）、天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；正己烷、乙酸乙酯（分析純）、國藥集團(tuán)化學(xué)試劑制造有限公司；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷：北京譜析科技有限公司；飛燕草素-葡萄糖苷：西寶生物科技（上海）股份有限公司；超純水：自制；酸性乙醇水溶液：自制；鈉型732陽離子交換樹脂：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

超聲波清洗器，KQ2200B型，昆山超聲儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)，MODULYOD-230型，Thermo Fisher Sciebti fic，美國；色譜分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），C18 ECOSIL HPLC COLUMN型，日本ECOSIL公司；紫外可見分光光度計(jì)，UV754N型，德國Thermo Scienti fic公司；SPD-20A型紫外檢測(cè)器；Unitary C18反相色譜柱 (10 mm×250 mm，5 μm)；高效液相色譜儀，A20型，日本Shimazu公司；精密電子天平，AE240型，瑞士Starorius公司；pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多公司；超低溫冰箱，美國Thermo公司；水浴鍋，DSY-2-8型，北京國華醫(yī)療器械廠；高速逆流色譜（內(nèi)徑1.6 mm，容積 280 mL，轉(zhuǎn)速 0～1000 r/min），TBE-300A 聚四氟乙烯柱，上海同田公司；制備型高效液相色譜儀，LC-8A 型，日本Shimadzu Corporation公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SY-2000型，上海榮亞生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茶樹紫芽花色苷的提取

取茶樣干粉21.96 g，花色苷提取條件參考文獻(xiàn)[12-14]，設(shè)置為：料液體積比1∶25、80%乙醇（加1%冰醋酸）、室溫避光浸提24 h、提取兩次，合并兩次浸提液，蒸發(fā)濃縮至膏狀后獲得提取物保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 脫脂

取茶樣干粉13.60 g，配置正己烷∶乙酸乙酯∶水混合溶劑（1∶1∶2，V/V/V），對(duì)茶樣提取液進(jìn)行萃取脫脂處理,萃取至有機(jī)層無色為止，收集脫脂液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 離子交換樹脂分離

以1.3.2得到的脫脂液為上樣液，經(jīng)鈉型732陽離子交換樹脂[15-16]吸附，樹脂前處理方法參照馬淑青等[15]，上樣液pH 值為3、上樣液流速為5 BV/h[17-18]，吸附至飽和為止；吸附完成后分兩次洗脫, 第一次洗脫：采用80%乙醇溶液洗脫，洗脫液流速3 BV/h，洗脫液合并收集10 BV濃縮至1 BV去有機(jī)相，得到濃縮液I，HPLC檢測(cè)分析濃縮液I的濃度；第二次洗脫：依次采用2 BV不同比率4%鹽酸-乙醇溶液洗脫，洗脫液流速3 BV/h，洗脫梯度為50%、60%、70%、80%、90%，按乙醇濃度分別收集洗脫液，2 BV合并濃縮至1 BV去有機(jī)相，得濃縮液Ⅱ，HPLC檢測(cè)分析濃縮液Ⅱ的濃度。

1.3.4 大孔樹脂除酸

離子交換樹脂的第二次洗脫液濃縮后經(jīng)D101大孔樹脂吸附樹脂去除鹽酸，濃縮收集液、冷凍干燥得到紫芽茶樹花色苷粗品粉末，粉末用甲醇溶解，HPLC檢測(cè)并計(jì)算粗品總花色苷純度（參照1.3.7）。

1.3.5 高速逆流色譜溶劑體系篩選與分離

按表1設(shè)計(jì)不同溶劑體系方案，按比例配置10 mL體系溶液。振蕩混勻后待靜置分層，移取3 mL下相加入少量上述花色苷粉末，再用3 mL上相萃取，分別檢測(cè)萃取前后花色苷組分的峰面積，各組分的分配系數(shù)（K值）計(jì)算方法參考文獻(xiàn)陳田等[19]，篩選最佳溶劑體系。

選取表1中最佳溶劑體系方案，高速逆流色譜分離參數(shù)參考文獻(xiàn)[8,19]：將最佳溶劑體系靜置12 h，兩相分離后超聲脫氣30 min。上相作固定相，下相作流動(dòng)相，將固定相以20 mL/min的流速泵滿管路，然后以850 r/min正轉(zhuǎn)，流速2 mL/min的條件泵入流動(dòng)相，溫度25℃，檢測(cè)波長280 nm。取20 mL下相溶解花色苷500 mg，進(jìn)樣20 mL后采集數(shù)據(jù)。根據(jù)高速逆流色譜峰峰型、保留率P和流出液情況判斷分離效果。根據(jù)色譜分步收集 110～130 min、138～159 min、251～271 min、280～299 min 時(shí)的流出物，合并相同化合物的流出液，減壓濃縮溫度為40℃，冷凍干燥備用。取少量干粉甲醇溶解，經(jīng)HPLC進(jìn)樣檢測(cè)。

1.3.6 半制備高效液相色譜制備花色苷及其組分的條件優(yōu)化

表1 不同溶劑體系設(shè)計(jì)方案Table 1 Designs of Different solvent systems

將高速逆流色譜法得到干粉用甲醇溶解，參考上述高效液相色譜條件，采用C18制備柱（20 mm×250 mm，10 μm），在波長 280 nm、柱溫30℃的條件下，控制其他條件不變，分別探究不同流動(dòng)相、不同流速、不同進(jìn)樣量、不同梯度洗脫方案對(duì)花色苷分離效果的影響[20]，方案設(shè)計(jì)如表2，確定最佳色譜條件，根據(jù)色譜圖分別收集不同組分，各組分收集濃縮后做二次進(jìn)樣分離。

表2 不同條件方案Table 2 Designs of Different condition scheme

1.3.7 花色苷含量分析方法

待檢測(cè)樣品液經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過膜，高效液相色譜分析方法參照劉林峰等[21]，每次進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次，按以下公式[7,22]計(jì)算樣品液中花色苷含量。

式中：c為花色苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg / mL）；m0為花色苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（g）；v0為標(biāo)準(zhǔn)品體積（mL）；A1為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；A0為花色苷峰面積；ω為總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg / g）；A3為花色苷峰面積；v1為待測(cè)樣品體積（mL）；m1為待測(cè)樣品質(zhì)量（g）；P 為花色苷得率（mg / g）；m2為總花色苷質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取、脫脂、離子交換柱色譜與大孔樹脂分離對(duì)花色苷得率的影響

萃取結(jié)果和離子色譜分離結(jié)果如表3。樣品粗提的條件為避光，提取后得率5.64 mg/g；再經(jīng)過有機(jī)相萃取脫脂處理、陽離子交換樹脂層析后，得率提升；對(duì)樹脂層析處理后的花色苷分析檢測(cè)，其純度為20.38%，說明其中含有較多的雜質(zhì)。

表3 前處理工藝結(jié)果Table 3 Result of pretreatment processes

2.2 高速逆流色譜最佳溶劑體系的篩選

目標(biāo)組分在兩相溶劑體系中的分配系數(shù)K值[8]影響高速逆流色譜法的分離效果，K值偏大則出峰耗時(shí)過長，目標(biāo)組分峰型變寬變矮，組分之間的分離度R較差；而K值偏小，各組分在固定相中的保留時(shí)間較短，出峰過快，導(dǎo)致流出組分難以分離。不同配比的溶劑體系的K值如表4所示，組別1、2、3、6中單個(gè)組分K值較大，組別4、5組分之間的K值相差較小，組分不能完全分離，篩選后確定組別7為最佳溶劑體系。

表4 不同溶劑體系的K值及分離度R值Table 4 K value and resolution R value in different solvent systems

在以乙酸乙酯-正丁醇-乙腈-0.1%三氟乙酸水（8∶35∶13∶60）為最佳的溶劑體系中，雜質(zhì)峰與目標(biāo)組分峰分離效果良好，保留率為56.8%，各組分在固定相中保留時(shí)間較長，可有效分離。收集流出液，經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，以樹脂吸附處理后的花色苷濃縮物為樣品，經(jīng)高速逆流色譜分離后，總花色苷得率達(dá)到160.59 mg/g。以高效液相色譜檢測(cè)流出液，得到物Ⅰ和Ⅱ，物質(zhì)Ⅰ主要是黃酮類物質(zhì)，而物質(zhì)Ⅱ主要是花色苷類物質(zhì)，總花色苷純度達(dá)到43.64%，將交換樹脂層析后的粗品純度提高一倍左右，由此可見，通過高速逆流色譜法可以分離出花色苷粗制品中黃酮類雜質(zhì)，并有效提高花色苷粗制品純度，適用于花色苷的純化工藝。

2.3 半制備型高效液相色譜法條件優(yōu)化

2.3.1 梯度洗脫篩選

通過調(diào)節(jié)各梯度的兩相組成、梯度的變化速率，從而影響目標(biāo)組分的分離效果?？刂屏鲃?dòng)相為Ⅱ、流速為10 mL/min、進(jìn)樣量為1 mL，考察梯度洗脫方案的結(jié)果如圖1所示，方案a出峰時(shí)間較晚，耗時(shí)較長；方案b、c出峰時(shí)間均提前，方案c出峰最早。相比于方案b的分離效果，方案c可實(shí)現(xiàn)各花色苷組分的有效分離，且實(shí)驗(yàn)消耗的流動(dòng)相最少，故選擇方案c用于后續(xù)研究。

2.3.2 洗脫流速篩選

在半制備高效液相色譜制備花色苷及組分過程中，流速會(huì)影響溶質(zhì)、色譜柱和流動(dòng)相之間的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致目標(biāo)組分保留時(shí)間的變化。一般來說，隨著流速的持續(xù)增加，色譜分辨率有降低的趨勢(shì)，而且過高的流速對(duì)于制備柱壽命的負(fù)面影響較大?？刂屏鲃?dòng)相為Ⅱ、梯度洗脫方案為c、進(jìn)樣量為1 mL，考察流速方案的結(jié)果如圖2所示，流速從5 mL/min增加到10 mL/min，出峰時(shí)間提前，耗時(shí)減??；隨流速增大至20 mL/min，出峰時(shí)間進(jìn)一步提前，但分離度明顯下降，峰型變差，無法有效達(dá)到分離的目的，綜合后選擇5 mL/min的低流速作為較優(yōu)的洗脫流速方案。

圖1 不同洗脫程序方案分離花色苷的HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC Chromatograms of different elution procedure

圖2 不同洗脫流速分離花色苷的HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC Chromatograms of different elution fl ow rate

2.3.3 進(jìn)樣量篩選

適當(dāng)增加單次進(jìn)樣量的優(yōu)點(diǎn)在于節(jié)約時(shí)間，減少流動(dòng)相消耗，但進(jìn)樣量過大，會(huì)出現(xiàn)柱壓過載、分離度下降的問題?？刂铺荻认疵摲桨笧閏、流動(dòng)相為Ⅱ、流速為5 mL/min，考察進(jìn)樣量的結(jié)果如圖3所示，進(jìn)樣量為0.5 mL時(shí)，分離效果較差，而進(jìn)樣量為2 mL時(shí)，出峰時(shí)間較晚，且分離度不如1 mL進(jìn)樣量時(shí)的分離效果，故選擇1 mL為最優(yōu)進(jìn)樣量方案。

2.3.4 流動(dòng)相篩選

控制梯度洗脫方案為c、流速為5 mL/min、進(jìn)樣量為1 mL，以甲醇為有機(jī)相的方案Ⅰ不能將花色苷組分有效分離，方案Ⅱ出峰較早，且分離效果優(yōu)于方案Ⅰ，而方案Ⅲ出峰時(shí)間雖較晚，但分離度較方案Ⅱ高，在保證分離度的前提下，綜合三個(gè)方案，最終選擇方案Ⅲ為最優(yōu)流動(dòng)相。

2.3.5 花色苷組分的制備

將高速逆流色譜純化后的花色苷在甲醇中溶解，按上述篩選獲得的最優(yōu)色譜條件：C18柱（20×250 mm，10 μm）制備柱，波長 280 nm，流動(dòng)相1%醋酸(A)-乙腈(B)、梯度洗脫（0～55 min，10%A～40%B），流速 5 m L/min，進(jìn)樣量為1 mL進(jìn)樣分離，根據(jù)出峰時(shí)間和峰形接收花色苷組分，各組分再濃縮二次進(jìn)樣分離。

圖3 不同進(jìn)樣量方案分離花色苷的HPLC色譜圖Fig. 3 HPLC Chromatograms of different injection volume

圖4 制備型HPLC第二次分離花色苷組分的HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatogram ofAnthocyanin components

二次進(jìn)樣分離收取了5種花色苷組分流出液，各花色苷組分經(jīng)分析型HPLC進(jìn)樣檢測(cè)（圖4），花色苷組分保留時(shí)間分別為14.8 min、23.1 min、28.4 min、31.3 min 和 33.6 min，純度分別達(dá)到40.68%，24.38%，35.75%，90.61%和60.53%，其中組分4純度最高。UV光譜圖顯示（圖5）組分1、組分2、組分3、組分 4和組分 5分別在 523 nm、482 nm、534 nm、532 nm和520 nm處有最大吸收峰，而這5種組分在波長280 nm附近也存在最大吸收峰，符合花色苷類物質(zhì)在可見光區(qū)500-540 nm附近和紫外光區(qū)280 nm附近存在最大吸收波長的特征[5,9,23]，同時(shí)組分2在326 nm處存在一個(gè)吸收峰，研究發(fā)現(xiàn)[24,25]花青素分子在326-329 nm處存在的吸收峰是由于咖啡酸酯化的原因，故推測(cè)組分2為?；ㄉ铡?/p>

圖5 制備型HPLC第二次分離花色苷組分的UV光譜圖Fig. 5 UV spectrum of Anthocyanin components

3 結(jié)論與討論

植物中花色苷本身的含量較低，而又因植物的種類不同，其含量存在差異，在茶樹中也是如此。已有研究表明[26-27]，茶樹中含飛燕草素-3-O-β-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-β-半乳糖苷、天竺葵素-3-蕓香糖苷等多種花色苷組分，而各種組分分子量、糖苷位置等不同，所以花色苷組分的功能及分子極性也會(huì)相應(yīng)地表現(xiàn)出差異，單一的分離技術(shù)可制備較高純度的花色苷，但可能會(huì)因提取條件的限制而存在花色苷變質(zhì)[12,28]、種類單一等問題，多種色譜方法結(jié)合并分離植物活成分性的研究也有報(bào)道[29]，因此，從植物中制備花色苷需要協(xié)同多種分離技術(shù)，可以克服因植物原料中花色苷含量低、花色苷組分類型多、極性不同等造成制備花色苷的技術(shù)缺點(diǎn)，從而達(dá)到高效分離純化植物中花色苷的目的。

本研究采用花色苷含量較高的紫芽茶樹品種，對(duì)樣品進(jìn)行前處理，整個(gè)過程在避光、酸性條件下進(jìn)行，獲得花色苷的提取物，后續(xù)制備的濃縮液也及時(shí)冷凍干燥保存，保證在最初的原料及實(shí)驗(yàn)過程中，減少花色苷因變質(zhì)的失損量，盡可能多的保留樣品中的花色苷。進(jìn)而以高速逆流色譜繼續(xù)純化花色苷，在該環(huán)節(jié)中，溶劑體系的優(yōu)化極為重要，其決定了花色苷產(chǎn)物的最終得率。在本研究中，酸乙醇粗提物中得率僅為5.64 mg/g，但已高于文獻(xiàn)報(bào)道的3.78 mg/g[12]，而經(jīng)過進(jìn)一步處理，并以篩選出最佳的溶劑體系進(jìn)行高速逆流色譜純化除雜，得率達(dá)到160.59 mg/g，而純度也由前處理的20.38%上升至43.64%，花色苷提取效率極大提升。最后采用半制備液相色譜，利用其分離純度高、可制備量大、分離效率高等[20,30]等優(yōu)點(diǎn)，分離高純度的花色苷組分，通過優(yōu)化的色譜條件，實(shí)驗(yàn)分離出5種花色苷組分，純度最高達(dá)90%以上，說明半制備液相色譜對(duì)于紫芽茶花色苷的分離效率與采用的色譜條件具有重要的關(guān)系。綜上所述，采用高速逆流色譜耦合半制備型液相色譜，分離純化紫芽茶樹花色苷的效率得到大幅提升，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在對(duì)紫芽茶樹花色苷及組分的分離中，高速逆流色譜結(jié)合半制備液相色譜是一種有效的分離制備花色苷的方法。

實(shí)驗(yàn)所分離的花色苷組分中純度有高于90%的組分，但也有組分因?yàn)榉蛛x條件的限制而僅有20%以上，這樣的純度尚且達(dá)不到質(zhì)譜鑒定的要求，其中組分2，根據(jù)文獻(xiàn)可推測(cè)其為?；ㄉ?，而這也需要對(duì)該組分深入的研究及分析，所以在花色苷分離純化的后續(xù)研究中，還是要以分離純化為基礎(chǔ)，制備純度更高的花色苷及其組分，協(xié)同多種工藝技術(shù)、把控關(guān)鍵環(huán)節(jié)及節(jié)點(diǎn)，深入分析在不同植物中花色苷類型、組分的存在方式及功能的差異性，從而真正達(dá)到制備高純度花色苷的目的，發(fā)揮植物功能成分研究開發(fā)與利用的價(jià)值。