成 楊，劉 振，趙 洋，楊培迪，羅軍武，楊 陽*

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，國家茶樹改良中心 湖南分中心，湖南 長沙 410125；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院 茶學(xué)系，湖南 長沙 410125）

江華苦茶是1987年湖南省認(rèn)定的優(yōu)良地方群體品種，主要分布在湖南省南嶺山脈江華瑤族自治縣，是寶貴的茶樹資源[1]。DNA序列分析是區(qū)分個體間遺傳差異最直接的方法，可提供基因組特異區(qū)的完全遺傳信息，在植物的物種系統(tǒng)進(jìn)化、分類和鑒定等方面起到了非常重要的作用[2-3]。作為DNA序列分析的一個部分，cpDNA序列有著相對保守、基因組較小、多拷貝、母系遺傳的特點，被運用于各種層次的系統(tǒng)學(xué)研究[4-5]，如被子植物基部類群[6]與物種系統(tǒng)進(jìn)化研究[7]等，也有利用cpDNA進(jìn)行山茶屬植物的親緣關(guān)系研究[8]。SSR分子標(biāo)記具有通用性高、共顯性遺傳和多態(tài)性好等特點，是構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜、圖位克隆、品種鑒定與指紋圖譜、親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究以及輔助選擇育種的有用工具，被廣泛應(yīng)用于茶樹遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)等研究[9-14]，但是傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記方法存在操作復(fù)雜、耗時耗力、不同批次數(shù)據(jù)整合困難、實驗安全風(fēng)險大等不足，給SSR標(biāo)記在茶樹中的應(yīng)用帶來一定困難[15-16]。

本研究在對江華苦茶進(jìn)行調(diào)查的基礎(chǔ)上，采用熒光SSR分子標(biāo)記與cpDNA序列分析技術(shù)相結(jié)合的方法，對4個江華苦茶自然居群的32份資源進(jìn)行了群體遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化研究，探討江華苦茶的親緣關(guān)系、遺傳多樣性水平及群體遺傳結(jié)構(gòu)，為江華苦茶資源的收集、保護(hù)和研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

參試的32份茶樹種質(zhì)資源：江華瑤族自治縣27份，其中碼市鎮(zhèn)龍灣村9份（MS）、蔚竹口鄉(xiāng)12份（WZK）和大錫鄉(xiāng)6份（DX），均為樹齡較大、小喬木型的典型古茶樹資源；湖南省茶葉研究所茶樹種質(zhì)資源圃苦茶資源5份（CYS）。實驗材料均取一芽二葉新梢，液氮迅速冷凍處理，將其保存在-40℃冰箱中備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物合成

本研究采用3對cpDNA引物（表1），cpDNA序列為團(tuán)隊前期篩選的結(jié)果，由天根生化科技有限公司進(jìn)行引物合成。15對SSR引物為團(tuán)隊已有的篩選結(jié)果，由上海生工公司合成，為了便于基因分型，在引物的5'端增加了一段序列（5'-CGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'），反應(yīng)體系中增加了一個熒光標(biāo)記引物（5'-FAMCGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'）。

表1 cpDNA引物序列Table 1 cpDNA primer sequence

1.2.2 PCR擴增

cpDNA測序的擴增體系見表2、PCR反應(yīng)程序見表3，擴增完成后，隨機抽取擴增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。SSR擴增體系見表4，采用降落式PCR，包括3個touchdown循環(huán)和后續(xù)的35個標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)。起始變性溫度為 94℃ 3 min，3個 touchdown循環(huán)為 94℃變性 30 s，68℃退火 1 min，每執(zhí)行一個循環(huán)后退火溫度降低2℃，72℃延伸1 min。35個標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)為 94℃變性 30 s，58℃退火 45 s，72℃延伸45 s。完成以上循環(huán)以后，在72℃保持10 min，最后將PCR產(chǎn)物冷卻到室溫或者4℃。PCR擴 增 在Thermo-5020型PCR儀（Thermo Fisher Scienti fic. Int’l trade Co., Ltd.）上進(jìn)行，擴增產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR 產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因分型。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

將cpDNA測序的結(jié)果采用DnaSP 5.1軟件進(jìn)行序列拼接，先剪去序列兩端不可靠的堿基序列和引物序列，然后再將正反兩個引物的序列進(jìn)行比對，對序列進(jìn)行編輯后獲得正反引物序列一致的DNA序列。通過MEGA 6.0軟件中的Clustal W 功能對所選材料的序列進(jìn)行比對，適當(dāng)手工校正，去除邊緣不準(zhǔn)確的部分序列，整理以待分析，計算變異堿基數(shù)[17]。采用MP法(most parsimonious tree, MP)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，對分支的可靠性評價使用靴帶值（bootstrap，1000次重復(fù)）分析，自展數(shù)值75% ～ 100%表示強支持率，50%～74%表示弱支持率，＜ 50%表示不支持[18]。使用DnaSP 5.1軟件對cpDNA序列進(jìn)行單倍型數(shù)目(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)、基因流(Nm) 、遺傳分化系數(shù)（FST）等的計算，并進(jìn)行 Tajima’s D、Fu and Li’s D*、Fu and Li's F* 的 中 性 檢 驗 (Neutrality tests)[19]及群體動態(tài)擴張的失配分布分析(Mismatch Distribution Analysis)。 采 用 Network 4.2.0.1軟件基于最大簡約性原則的中間連接網(wǎng)法分析(median-joining networks)構(gòu)建不同單倍型間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖[20]。利用Arelequin 3.11軟件中的 AMOVA( Analysis of Molecular Variance) 分析方法，基于cpDNA數(shù)據(jù)檢測群體間和群體內(nèi)的遺傳變異[21]。

表2 cpDNA擴增體系Table 2 cpDNA ampli fication system

表3 PCR反應(yīng)程序Table 3 PCR reaction procedure

表4 SSR擴增體系Table 4 SSR ampli fication system

使用 Popgen version 1.31 軟件計算各 SSR 標(biāo)記和居群的位點數(shù)（na）、有效位點數(shù)（ne）、Shannon信息指數(shù)（I）、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho）和Nei’s觀測雜合度（Nei），計算居群間遺傳一致度和遺傳距離，并進(jìn)行群體間的基因流（Nm）和F統(tǒng)計（F-Statistics）計算。采用ntsys 2.10e軟件進(jìn)行相似系數(shù)計算和聚類分析，利用Arelequin 3.11軟件中的AMOVA( Analysis of Molecular Variance) 分析方法 ( Excof fier et al., 2005)，基于 SSR 數(shù)據(jù)檢測群體間和群體內(nèi)的遺傳變異。

2 結(jié)果分析

2.1 遺傳多樣性分析

2.1.1 cpDNA序列分析

3對引物測序在去除邊緣不可靠部分后，分 別 獲 得 634bp（1F-724R）、499 bp（rbclarev）、532 bp（rbcla-ajf634）的序列長度。序列的變異位點數(shù)量分別為5個、4個、4個。變異率從高到低分別是rbcla-rev（0.80%）、1F-724R（0.79%）和rbcla-ajf634（0.75%）。將3個序列對齊后依次拼接，共在4個居群中產(chǎn)生了5個單倍型（表5），單倍型數(shù)從多到少的居群依次為 WZK(4)、MS(3)、DX(3)和 CYS(2)。居群的Hd和π的大小順序不一致（表7），Hd最大的為居群WZK，最小的為居群CYS；π最大的為居群MS，最小的為居群DX。江華苦茶群體單倍型多樣性為Hd=0.726，核苷酸多樣性為π=0.00233，群體遺傳多樣性相對較高。

2.1.2 SSR分子標(biāo)記

15對SSR引物中擴增并分型成功的有13對（表6），共擴增等位位點99個，平均每對引物7.62個，位點數(shù)最多的為A05和A10（13個），最少的是A08（4個）；有效位點最多的是A05（6.90個），最少的是A15（1.65個）；Shannon信息指數(shù)最大的為A05（2.19），最小的是A15（0.82）。4個居群中（表6），平均na、ne、He、Ho、Nei最大的分別為5.23、3.13、0.62、0.65和0.60，最低的分別是3.54、2.48、0.50、0.59和0.54。遺傳多樣性最高的是蔚竹口鄉(xiāng)居群（WZK），最低的是大錫鄉(xiāng)群體（DX）。江華苦茶群體的He、Ho和Nei分別為0.56、0.65和0.64，群體具有較高的遺傳多樣性（表7）。

2.2 資源間的親緣關(guān)系

表5 3個cpDNA序列對齊產(chǎn)生5個單倍型的變異位點Table 5 Variable sites of the aligned sequences of three chloroplast DNA fragments in the 5 haplotypes (H1–H5)

表6 13對引物的擴增結(jié)果Table 6 13 ampli fication results of primers

表7 江華苦茶不同群體的遺傳多樣性Table 7 Genetic diversity of different populations of Jianghua bitter tea

利用MP法構(gòu)建了江華苦茶32份資源的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結(jié)果表明，對照豬婆茶單獨聚為一類（gene22），參試資源并沒有依照地理類群聚為不同的小類群。

利用DnaSP 5.1軟件對江華苦茶群體進(jìn)行單倍型分析，分析結(jié)果表明，32個樣品被分為了5種單倍型，各單倍型所包含的種質(zhì)情況見表8。其中數(shù)量最多的單倍型為H3，包含13份資源；其次是H4，有9份資源。對比單倍型和分子系統(tǒng)樹的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)樹當(dāng)中H5和H4單倍型聚在了一起，單倍型H5和H4的親緣關(guān)系較近，而與其它單倍型的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表8 基于cpDNA的江華苦茶單倍型的分布Table 8 Distribution of haplotypes of Jianghua bitter tea based on cpDNA

利用NETWORK構(gòu)建葉綠體單倍型的網(wǎng)狀進(jìn)化圖（圖2），H3處于整個網(wǎng)絡(luò)圖的中心節(jié)點上，包含的資源數(shù)量最多。一般認(rèn)為古老單倍型多位于網(wǎng)絡(luò)圖的內(nèi)部節(jié)點，而新衍生出的單倍型一般位于外部節(jié)點，H3可能屬于苦茶中比較原始的單倍型。以H3為基礎(chǔ)，分別按照三條演化路線獲得H1、H2、H4這三種單倍型，最后由H4演化出H5。

圖1 基于三個序列和最大簡約法（MP）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖中數(shù)字表示抽樣檢驗的自展百分比）Fig. 1 Phylogenetic tree based on three sequences and maximum parsimony (MP) (the figure shows the percentage of selfexpansion of the sampling test)

圖2 cpDNA5種單倍型網(wǎng)狀進(jìn)化關(guān)系圖Fig. 2 cpDNA 5 haplotype network evolution diagram

圖3 ntsys對32個資源進(jìn)行聚類分析構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig. 3 ntsys system tree constructed by cluster analysis of 32 resources

采用ntsys 2.10e軟件對SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，依照相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析見圖3（cpDNA實驗中22號的對照組在該實驗當(dāng)中沒有使用，因此在該實驗當(dāng)中22號之后的資源排號均前進(jìn)一位）。按照聚類圖的結(jié)果，2號和14號、4號和13號相似性均高于0.95，而這兩組在單倍型分析當(dāng)中也屬于同一單倍型，表明這兩組資源的親緣關(guān)系非常接近。而在32個樣品當(dāng)中，還有兩個樣品（3號和27號）與其他樣品相似度均低于0.75，而在cpDNA的單倍型分析時，它們并沒有與其他樣品有明顯差異，考慮到cpDNA的母系遺傳特性，這兩個樣品的父本與其他樣品存在比較大的差異性。在0.85以上的區(qū)間，存在一個集合緊密，數(shù)量眾多的小集群，將該集群與cpDNA單倍型分析結(jié)合起來觀察時，發(fā)現(xiàn)該集群包括了H3（4、8、13、16）、H4（17、20、21、32）和 H5（31）三個處于一條演化鏈上的單倍型，屬于H3的四個資源相互之間關(guān)系最為密切，分別屬于H4和H5的21號資源和31號資源的遺傳相似度高達(dá)0.93，這個小集群是H3通過H4演化出H5在核基因上的體現(xiàn)。

2.3 居群遺傳結(jié)構(gòu)分析

采用13個SSR標(biāo)記對所有的位點進(jìn)行連鎖不平衡檢驗，僅有3個位點是不連鎖的(P＞0.05)（表6），群體的近交系數(shù)FIS為正值（0.0344），而且一些位點顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡，表明群體的近交程度增加，純合子比例升高。群體間的遺傳分化系較小(FST=0.0971），分化程度較低，基因流較高（Nm=2.3254）。將SSR的檢測結(jié)果分別進(jìn)行AMOVA分析，結(jié)果表明江華苦茶的遺傳變異主要出現(xiàn)在居群內(nèi)（90.98%），居群間的遺傳差異很?。ū?）。

表9 SSR實驗數(shù)據(jù)AMOVA分析結(jié)果（FST：0.09107）Table 9 AMOVA analysis results of SSR experimental data(FST： 0.09107)

利用DnaSP 5.1軟件對四個居群的遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，居群遺傳分化系數(shù)FST=0.26019( P＜0.0001)，基因流Nm=0.71，居群間的遺傳分化較大，基因流較弱。這個結(jié)果似乎表現(xiàn)了江華苦茶cpDNA的遺傳變異主要存在于居群間，而對cpDNA實驗數(shù)據(jù)采用AMOVA分析之后，得出的結(jié)果則是變異依然主要存在于居群內(nèi)（表10），遺傳分化并不明顯。

表10 cpDNA實驗數(shù)據(jù)AMOVA分析結(jié)果（FST ： 0.10710）Table 10 AMOVA analysis results of cpDNA experimental data (FST： 0.10710)

2.4 中性檢驗與失配分析

利用DnaSP 5.1軟件對江華苦茶群體進(jìn)行中性 檢 驗 ( Tajima，1989；Fuet al.，1993) ， 檢驗結(jié)果表明：參試資源的 Tajima’s D、Fu and Li’s D 和 Fu and Li’s F 均為正值，統(tǒng)計檢驗也不存在顯 著 性（Tajima's D： 0.65107，P＞ 0.10，F(xiàn)u and Li’s D* test statistic： 1.04908，P＞ 0.10，F(xiàn)u and Li’s F* test statistic： 1.08399，P＞ 0.10） 表 明 資源群體未經(jīng)過擴張事件。對單倍型進(jìn)行了失配分析，若群體經(jīng)歷了擴張或瓶頸效應(yīng)，將導(dǎo)致失配分布曲線呈現(xiàn)單峰; 若群體處于動態(tài)平衡或緩慢衰退狀態(tài)，沒有經(jīng)歷擴張，則失配分布曲線為雙峰或多峰 ( Tajima，1989；Fu et al.，1993)；結(jié)果顯示，失配分布曲線呈多峰曲線，表明江華苦茶群體均沒有經(jīng)歷擴張（圖4）。

圖4 失配分布曲線Fig. 4 Mismatch distribution curve

3 討論

3.1 江華苦茶群體遺傳多樣性

13對引物在32個江華苦茶資源中擴增的平均等位位點為7.62個，有效位點3.38，信息指數(shù)1.39，高于Zhao[22]等和Yao[23]等的研究結(jié)果，而與Fang[24]等和Wang[25]等的研究結(jié)果一致。這種豐富的等位位點與檢測資源的遺傳多樣性有關(guān)，也與SSR擴增產(chǎn)物的檢測技術(shù)等有關(guān)。本研究采用的熒光標(biāo)記通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測，其分辨率要遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，產(chǎn)生的等位位點就相對要多一些。

江華苦茶群體的Ho、He和Nei分別為0.56、0.65和0.64，高于Fang等和Yao 等的研究結(jié)果：Fang等采用58個SSR標(biāo)記對185份中國茶樹栽培品種的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，Ho平均為0.340；Yao等采用96個SSR標(biāo)記對中國14個省份共450份茶樹資源的研究，有13個省份的Nei小于本研究的0.64。cpDNA序列分析表明，江華苦茶群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均較高，具有較高的遺傳多樣性。

3.2 江華苦茶群體親緣關(guān)系

本研究對32種樣品的cpDNA通過MP法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，將樣品分為了四個大類，大類內(nèi)部自展百分比均在80%以上，獲得了5種單倍型，對單倍型研究構(gòu)建了網(wǎng)狀分析進(jìn)化圖，發(fā)現(xiàn)了一個比較明顯的cpDNA演化線路（H3-H4-H5）。nSSR標(biāo)記的相似度研究32個樣品之間的親緣關(guān)系，兩個樣品（3號、27號）與其他樣品相似度較遠(yuǎn)，以及1個聚類比較緊密的小集群（4、8、13、16、17、20、21、31、32），綜合研究該集群內(nèi)部相似度和樣品在cpDNA單倍型當(dāng)中位置能夠很直觀的體現(xiàn)出這些樣品之間的親緣關(guān)系。

3.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)與基因流

基于SSR的江華苦茶群體的遺傳分化水平(FST=0.0971)，顯著小于基于cpDNA的遺傳分化(FST=0.26019 )，主要是因為核分子標(biāo)記，基因流通過花粉和種子兩種方式傳播，而單親遺傳沒有重組的cpDNA基因流只能通過種子流來傳播，符合雙親遺傳的核基因組分子標(biāo)記更傾向于減弱群體間的遺傳分化水平的觀點。從實驗數(shù)據(jù)結(jié)果來看，花粉流和種子流的比值要低于松屬植物、川梨、珙桐等異交植物，表現(xiàn)出了較強的種子流。茶組植物為異花授粉且自交不親和，江華群體的近交系數(shù)表現(xiàn)出正值(FIS=0.0344)不符合異交植物隨機交配原則，表明江華苦茶在遺傳演化過程中受到外來因素的影響，可能與人為的選擇、運輸和繁殖有關(guān)。