鐘佳男，唐嵐芳，劉 婷，楊莎莎，陳乃潔，蔡 晶，肖紹堅(jiān)

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)2017級(jí)碩士研究生，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是常見的老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，其病理改變主要是黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)元的變性壞死[1]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是PD發(fā)病機(jī)制之一。適當(dāng)?shù)腅RS能夠協(xié)助細(xì)胞維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，但持續(xù)或過度的ERS可誘發(fā)ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡[2]。凋亡信號(hào)激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）的激活是ERS引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[3]。研究表明，持續(xù)過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡與其激活特異性凋亡介質(zhì)caspase-12有關(guān)[4]。課題組前期研究表明中藥肉蓯蓉能改善帕金森病模型大鼠的行為障礙，對(duì)帕金森病模型大鼠的神經(jīng)元起到保護(hù)作用[5]。本研究通過觀察松果菊苷對(duì)PD模型大鼠行為學(xué)及ERS相關(guān)蛋白ASK1、caspase-12的影響，進(jìn)一步探討其防治PD的作用機(jī)制。

1 材 料

動(dòng)物。SPF級(jí)成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量215～245g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）2018-0004。福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供普通級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施，許可證號(hào)：SYXK（閩）2014-0005。

試劑。松果菊苷購自中國南京景竹公司，將松果菊苷粉末加入純水中稀釋成2mg/mL的松果菊苷水溶液，4℃下低溫避光保存。魚藤酮注射液取魚藤酮粉末（美國Sigma公司），加葵花油（美國Sigma公司）稀釋成1.5mg/mL的魚藤酮葵花油液，4℃下低溫避光保存。ASK1抗體（英國abcam公司）、caspase-12抗體（英國abcam公司）、β-actin抗體（武漢三鷹公司）。

儀器。5417R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），轉(zhuǎn)膜儀與電泳槽（美國Bio-Rad公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），DU-650型蛋白分析儀（美國Beckman公司）。

2 方 法

2.1 PD模型的建立及分組

每組取8只SD大鼠，采用大鼠頸背部皮膚下注射魚藤酮葵花油造模法[6-7]，模型組與治療組大鼠頸背部皮下注射魚藤酮葵花油乳液（0.1mL/100g×d），連續(xù)注射14天，建立PD模型。溶劑對(duì)照組大鼠按照頸背部皮下注射葵花油（0.1mL/（100g×d）連續(xù)注射14天；正常組不予處理。

2.2 干預(yù)方法

造模結(jié)束后，治療組予松果菊苷水溶液1mL/（100g×d）灌胃，連續(xù)治療2周。其余組予純水1mL/（100g×d）灌胃，連續(xù)2周。

2.3 行為學(xué)分析

治療組給藥前1天、給藥第14天分別做行為學(xué)步幅試驗(yàn)，裝置1個(gè)木盒子（長(zhǎng)40cm，寬5cm，高12cm），1條跑道（長(zhǎng)44cm，寬5cm），并且將跑道穿過，不透光木盒。在跑道上放上白紙（長(zhǎng)44cm，寬5cm），然后將大鼠的左、右前爪分別涂上黑色、紅色墨水，刺激大鼠在白紙跑道上行走并且穿過木盒子，分別測(cè)量白紙上大鼠的黑色、紅色墨水印記前后之間的距離，并記錄其中最長(zhǎng)距離（對(duì)應(yīng)大鼠的最快速度），大鼠在行走過程中停止或者有明顯減速的結(jié)果要排除，并且重新測(cè)試，每只大鼠步幅試驗(yàn)需重復(fù)測(cè)量3次，結(jié)果取平均值。

2.4 取材

在松果菊苷干預(yù)14天后開始取材。大鼠腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后，斷頭取腦，將腦置于冰盤迅速取出紋狀體（正中線旁開3 mm，前囟前1 mm，硬膜下4.5 mm），再用0.9%氯化鈉溶液（提前置于-4℃冰凍處理）洗凈組織中血液，濾紙吸干后存放于-80℃冰箱。

2.5 Western blot檢測(cè)

組織稱重后加組織裂解液（12.5 μL/mg）并在低溫環(huán)境下充分研磨，置于4℃離心機(jī)中離心15 min（12000 r/min），抽取上清液后用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。將樣品置于沸水中加熱10 min使蛋白充分變性。配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂，封閉2 h后加入提前配制的ASK1、caspase-12抗體液中（抗體∶抗體稀釋液=1∶1000），4℃過夜。次日TBST洗膜，加入二抗（抗體∶抗體稀釋液=1∶10000），室溫孵育1h后再次洗膜。ECL發(fā)光顯色檢測(cè)：加入顯色劑，置于成像儀內(nèi)曝光成像，用ImageLab軟件分析后并記錄條帶灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS23.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用（±s

）表示，組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊采用LSD法，方差不齊則采用Games-Howell法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

造模后14天，與正常組比較，模型組及治療組步幅縮短（P＜0.05），溶劑對(duì)照組與正常組步幅相近（P＞0.05）。給藥14天，與正常組比較，模型組的步幅縮短（P＜0.05）；與正常組比較，治療組步幅縮短（P＜0.05）；與模型組比較，治療組步幅的長(zhǎng)度有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 藥物干預(yù)前后各組老鼠步幅試驗(yàn)比較 （cm，±s）

表1 藥物干預(yù)前后各組老鼠步幅試驗(yàn)比較 （cm，±s）

注：與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

組別 松果菊苷給藥前1天 松果菊苷給藥第14天正常組 14.59±1.21# 13.96±1.83#溶劑對(duì)照組 13.63±0.73# 13.53±0.55#模型組 10.45±1.03* 10.66±1.13*治療組 10.33±0.91* 11.86±1.21*

3.2 Western blot檢測(cè)紋狀體ASK1、caspase-12蛋白表達(dá)

與正常組比較，模型組中ASK1、caspase12蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。與模型組比較，治療組ASK1、caspase-12蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠紋狀體中ASK1、caspase-12蛋白表達(dá)比較 （±s）

4 討 論

帕金森病是一種慢性進(jìn)行性疾病，是第二大常見的神經(jīng)退行性疾病。由于PD病情的進(jìn)展和耐藥性的產(chǎn)生，很多神經(jīng)保護(hù)治療效果不佳[8]。

PD屬中醫(yī)“顫證”范疇?！夺t(yī)宗己任編》記載：“大抵氣血俱虛，不能榮養(yǎng)筋骨，故為之振搖，而不能主持也”，闡述了本病以肢體震顫為主癥，認(rèn)為氣血虧虛，精髓虧損，無以充養(yǎng)腦竅、筋骨所致，“振搖不止”的根本在于腎虛精虧?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》云：“人之腦髓空者，……知覺運(yùn)動(dòng)俱廢，因腦髓之質(zhì)，原為神經(jīng)之本源也?！笔状沃赋鲋w運(yùn)動(dòng)功能障礙與腦精衰少有關(guān)，而腦之精髓本源在腎，腎氣盛則精足氣旺，聰明靈動(dòng)，筋骨強(qiáng)勁，動(dòng)作敏捷；若腎氣不足，則神識(shí)不清，頭搖肢顫，筋脈拘緊，持物不穩(wěn)。

肉蓯蓉性味甘溫，可補(bǔ)腎益精，主治腎虛精虧。研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉等中藥制劑對(duì)PD模型動(dòng)物具有神經(jīng)保護(hù)作用[9]。肉蓯蓉顆粒對(duì)帕金森病模型大鼠黑質(zhì)紋狀體的多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用[10]。其主要成分松果菊苷能逆轉(zhuǎn)PD模型大鼠紋狀體及海馬細(xì)胞外液中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量降低[11]，并可通過GRP94/BIP-ATF4-CHOP信號(hào)通路緩解ERS[12]。

持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可激活凋亡信號(hào)通路，肌醇需求酶1（Ire1α）通路介導(dǎo)的凋亡途徑和 caspase-12途徑為其中重要的通路。一方面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)可激活I(lǐng)re1α，進(jìn)而激活凋亡關(guān)鍵蛋白ASK1，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另一方面caspase-12可被異常的ERS激活并進(jìn)一步激活其下游的凋亡執(zhí)行因子caspase-3，從而獨(dú)立地介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)松果菊苷治療后，PD模型大鼠的行為學(xué)步幅距離較模型組有所延長(zhǎng)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明松果菊苷能改善PD模型大鼠部分運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。Western blot檢測(cè)顯示，松果菊苷組PD模型大鼠較模型組ASK1蛋白與caspase-12蛋白表達(dá)明顯降低，表明松果菊苷能逆轉(zhuǎn)PD模型大鼠部分ERS相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)，對(duì)PD模型大鼠神經(jīng)元功能有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制IRE1a-ASK1-JNK通路與caspase-12途徑來阻止異常ERS。