楊陽 楊波

摘 要：采用響應(yīng)面法對(duì)保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，Plackett-Burman （PB）設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基中各因素影響的效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：糖蜜、工業(yè)蛋白胨和CaCO3對(duì)生物量影響顯著。

關(guān)鍵詞：保加利亞乳桿菌;培養(yǎng)基優(yōu)化;響應(yīng)面

乳酸菌主要存在于畜、禽腸道以及奶制品、酒曲等食品中，其作為微生態(tài)制劑還廣泛地應(yīng)用于食品[1]、保健[2，3]和動(dòng)物飼料等領(lǐng)域;乳酸菌具有抗菌、維持微生態(tài)平衡[4]、抑癌和增強(qiáng)免疫力[5]等重要功能，且能賦予食品特殊的風(fēng)味，是極有價(jià)值和開發(fā)前景的菌種。因而，研制經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、易收獲菌體且活菌數(shù)高的增殖培養(yǎng)基是大多研究者共同關(guān)心的問題。

在乳酸菌優(yōu)化培養(yǎng)基研究方面，劉云鶴等[6]通過正交及混料回歸試驗(yàn)確定了高效經(jīng)濟(jì)的乳酸菌增殖培養(yǎng)基配方，可使發(fā)酵液中的乳桿菌和植物乳桿菌的活菌數(shù)分別達(dá)到 6.02×109 cfu/mL、5.88×109 cfu/mL。付榮霞等[7]通過正交實(shí)驗(yàn)研究了幾種果蔬汁的添加量、培養(yǎng)時(shí)間、黃豆發(fā)芽時(shí)間對(duì)乳酸菌生長的影響，確定了最優(yōu)的發(fā)酵工藝，在此條件下，乳酸菌的菌數(shù)為13.8×107 cfu/mL，pH為3.97。本研究在MRS的基礎(chǔ)上，對(duì)其培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化，選出了對(duì)保加利亞乳桿菌適合規(guī)?；a(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)后期高密度發(fā)酵及活性乳酸菌的制備有指導(dǎo)意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料與儀器

1.1.1? 材料

保加利亞乳桿菌：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC 23764）。

1.1.2? 培養(yǎng)基

菌種斜面培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、磷酸氫二銨2.0 g、吐溫80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、七水硫酸鎂0.58 g、一水硫酸錳0.25 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，固體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂，pH 6.4。

種子培養(yǎng)基、優(yōu)化前的基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，250 mL 三角瓶，裝量50 mL。

1.2? 方法

1.2.1? 生物量的測定

細(xì)胞OD值的測定：取菌體發(fā)酵液5 mL加入10 mL的離心管中，5000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀（菌體），再加入5 mL的蒸餾水反復(fù)搖勻洗滌，離心棄上清，重復(fù)洗滌至無色。稀釋后的菌體在600 nm 波長處，用蒸餾水作空白進(jìn)行測定，OD600nm=OD讀數(shù)×稀釋倍數(shù)[8]。

1.2.2? 培養(yǎng)基優(yōu)化

通過單因子試驗(yàn)確定保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基的最適碳、氮源，用Design Expert 8.0軟件中2水平篩選出影響保加利亞乳桿菌生物量的顯著因子，再通過爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)顯著因子的水平進(jìn)行優(yōu)化[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1? Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

考慮到實(shí)際生產(chǎn)中的原料成本及來源，選定糖蜜、工業(yè)蛋白胨進(jìn)行單因素優(yōu)化預(yù)試驗(yàn)，確定其最佳濃度分別為150 mL/L和3%（資料未顯示）。

用Design Expert按Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將各個(gè)因素設(shè)計(jì)成高 （+1） 和低 （-1） 2個(gè)水平，高水平是低水平的1.25倍。

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)每組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)此結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，糖蜜、酵母粉、工業(yè)蛋白胨、磷酸氫二鉀、一水硫酸錳和磷酸氫氨表現(xiàn)為正效應(yīng)，七水硫酸鎂和碳酸鈣表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。糖蜜、工業(yè)蛋白胨、酵母粉、碳酸鈣的P值分別為0.0248、0.0160、0.0277、0.0261，可信度均大于95%，表現(xiàn)為顯著。工業(yè)蛋白胨的濃度對(duì)乳酸菌生物量影響最大，其次是糖蜜和碳酸鈣。因此確定工業(yè)蛋白胨、糖蜜、碳酸鈣為主要影響因素，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2? 響應(yīng)面分析的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定了顯著因素濃度的取值區(qū)間。利用Design Expert進(jìn)行中心組合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將最陡爬坡試驗(yàn)的3 個(gè)因素糖蜜、工業(yè)蛋白胨和碳酸鈣分別標(biāo)記為X1、X2、X3，以發(fā)酵10 h后的OD值作為響應(yīng)值，記為Y，各變量水平見表4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。根據(jù)表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過Design Expert進(jìn)行顯著性分析，建立多元二次回歸方程：

Y=6.53+0.033X1+0.12X2-0.034X3+0.016X1X2-0.16X1X3-0.034X2X3-0.11X12-0.12X22-0.14X32

方程的方差分析結(jié)果，模型大于F值的概率P<0.01，表明模型非常顯著，對(duì)響應(yīng)值Y的影響非常顯著，可信度較高;模型失擬項(xiàng)的P值為0.1251，不顯著，決定系數(shù)R2=0.9162，說明因變量與考察的自變量之間的線性關(guān)系顯著;綜上所述，使用該模型可以較好的對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.4? 最佳濃度的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)上述回歸方程，以確認(rèn)糖蜜、工業(yè)蛋白胨、碳酸鈣3個(gè)因素對(duì)乳酸菌生物量的影響，3個(gè)因素兩兩相互作用的圖像開口均是向下的，說明可以由擬合方程求出預(yù)測的生物量的最大值。由Design Expert軟件分析得到最適培養(yǎng)基組成為糖蜜180 mL/L，工業(yè)蛋白胨3.52%，碳酸鈣0.15%，酵母浸粉3%、磷酸氫二鉀0.2%、七水硫酸鎂0.15%、輕質(zhì)碳酸鈣0.1%、一水硫酸錳0.002%、磷酸氫氨0.15%。預(yù)測在此組成條件下，乳酸菌生物量最大，OD600nm值為6.50。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊潔彬. 乳酸菌[M]. 輕工業(yè)出版社， 1996.

[2] 陳杰， 徐沖， 孫翠煥，等. 乳酸菌在食品工業(yè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J]. 微生物學(xué)雜志， 2012， 32（3）：91-94.

[3] 田永峰， 吳天祥， 胡曉瑜，等. 乳酸菌在釀造和食品工業(yè)上的應(yīng)用[J]. 釀酒科技， 2007（4）：90-93.

[4] 趙龍飛. 乳酸菌的保健功能及其在食品中的應(yīng)用研究[J]. 中國調(diào)味品， 2009， 34（6）：30-33.

[5] 張金桃， 周傳云， 侯愛香. 乳酸菌的保健功能及其保健機(jī)理的研究[C]// 益生元國際論壇. 2007.

[6] 劉云鶴. 高效乳酸菌增殖培養(yǎng)基的篩選[J]. 淮海工學(xué)院學(xué)報(bào).自然科學(xué)版， 2003， 12（4）：59-62.

[7] 付榮霞， 鮑雅楠， 崔艷，等. 幾種果蔬汁對(duì)乳酸菌增殖的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 40（6）：187-189.

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[9] Velly H， Fonseca F， Passot S， et al. Cell growth and resistance of Lactococcus lactis subsp. lactis TOMSC161 following freezing， drying and freeze-dried storage are differentially affected by fermentation conditions[J]. Journal of Applied Microbiology， 2014， 117（3）： 729-740.