鄧臨新 李 崧

(1.云南警官學院，云南·昆明 650223；2.云南農業(yè)大學，云南·昆明 650221)

前言

金屬有機框架材料(Metal Organic-Framworks)作為先進前沿材料中的一種，是近十幾年來配位化學發(fā)展的最快的一個方向。它具備超分子網狀的結構并結合了復合高分子和配位化合物兩者的特點，且兼具無機化合物和有機化合物兩者的優(yōu)點[注]Li， W. B.; Yang， Z. H.; Zhang， G. L.， et al.， Stiff metal-organic framework-polyacrylonitrile hollow fiber composite membranes with high gas permeability [J]. J Mater Chem A 2014， 2(7): 2110-2118. Li， G. Y.; Zhang， B.; Yan， J.， et al.， The directing effect of linking units on building microporous architecture in tetraphenyladmantane-based poly(Schiff base) networks [J]. Chem Commun 2014， 50(15): 1897-1899.。此類框架材料的結構可實現多樣化的設計及實現可調控的孔道大小與結構，因此可以實現半定向設計合成[注]Ji， Q.; Lirag， R. C.; Miljanic， O. S.， Kinetically controlled phenomena in dynamic combinatorial libraries [J]. Chem Soc Rev 2014， 43(6): 1873-1884. Hasell， T.; Culshaw， J. L.; Chong， S. Y.， et al.， Controlling the Crystallization of Porous Organic Cages: Molecular Analogs of Isoreticular Frameworks Using Shape-Specific Directing Solvents [J]. J Am Chem Soc 2014， 136(4): 1438-1448.。此類分子功能材料研究跨越了晶體學、材料學、無機化學、配位化學、有機化學等諸多領域并成功實現領域交叉[注]Chen， X. W.; Wan， L.; Huang， J. M.， et al.， Nitrogen-containing carbon nanostructures: A promising carrier for catalysis of ammonia borane dehydrogenation [J]. Carbon 2014， 68: 462-472. Zhang， W.; Jin， Y. H.; Yang， H. S.， et al.， Development and applications of 3D covalent organic polyhedrons (COPs) and porous polymer frameworks (PPFs) through dynamic covalent chemistry [J]. Abstr Pap Am Chem S 2013， 246-249. Yuan， Y.; Sun， F. X.; Zhang， F.， et al.， Targeted Synthesis of Porous Aromatic Frameworks and their Composites for Versatile， Facile， Efficacious， and Durable Antibacterial Polymer Coatings [J]. Adv Mater 2013， 25(45): 6619-6624.。

金屬有機框架材料作為一種新型納米多孔材料，與活性炭和沸石比較，在氣體的捕獲、儲存與分離[注]Yan， W.; Song-Quan， S.; Ju-Hong， Z.， et al.， Synthesis， structural diversities and properties of a series of transition metal-organic frameworks based on asymmetric dicarboxylic acid and N-donor auxiliary ligand [J]. Inorg Chem Commun 2013， 30: 5-12.[注]Li， Y. W.; Yang， R. T.， Hydrogen storage in metal-organic and covalent-organic frameworks by spillover [J]. Aiche J 2008， 54(1): 269-279.[注]Bureekaew， S.; Sato， H.; Matsuda， R.， et al.， Control of Interpenetration for Tuning Structural Flexibility Influences Sorption Properties [J]. Angew Chem Int Edit 2010， 49(42): 7660-7664.；藥物的緩釋[注]Dinca， M.; Han， W. S.; Liu， Y.， et al.， Observation of Cu2+-H2 interactions in a fully desolvated sodalite-type metal-organic framework [J]. Angew Chem Int Edit 2007， 46(9): 1419-1422.；光、磁、電科學[注]Lassig， D.; Lincke， J.; Moellmer， J.， et al.， A Microporous Copper Metal-Organic Framework with High H2 and CO2 Adsorption Capacity at Ambient Pressure [J]. Angew Chem Int Edit 2011， 50(44): 10344-10348.，催化科學[注]Lee， Y. G.; Moon， H. R.; Cheon， Y. E.， et al.， A comparison of the H2 sorption capacities of isostructural metal-organic frameworks with and without accessible metal sites: [{Zn2(abtc)(dMf)(2)}(3)] and [{Cu2(abtc)(dMf)(2)}(3)] versus [{Cu2(abtc)}(3)] [J]. Angew Chem Int Edit 2008， 47(40): 7741-7745.[注]Li， B. Y.; Zhang， Z. J.; Li， Y.， et al.， Enhanced Binding Affinity， Remarkable Selectivity， and High Capacity of CO2 by Dual Functionalization of a rht-Type Metal-Organic Framework [J]. Angew Chem Int Edit 2012， 51(6): 1412-1415.，手性拆分[注]Duan， J. G.; Yang， Z.; Bai， J. F.， et al.， Highly selective CO2 capture of an agw-type metal-organic framework with inserted amides: experimental and theoretical studies [J]. Chem Commun 2012， 48(25): 3058-3060.[注]Lin， Q. P.; Wu， T.; Zheng， S. T.， et al.， A chiral tetragonal magnesium-carboxylate framework with nanotubular channels [J]. Chem Commun 2011， 47(43): 11852-11854.等應用領域都表現非常出色并有巨大的應用潛力，已成為新型功能材料的研究熱點。

洛貝林是從山梗菜中提取出來的一種生物堿，它是中樞興奮藥的一種，可以做到選擇性地刺激頸動脈體中的化學感受器，反射性引起迷走神經中樞、呼吸中樞與血管運動中樞興奮[注]Roni M A， Rahman S. Lobeline attenuates ethanol abstinence-induced depression-like behavior in mice.[J]. Alcohol， 2017， 61.。在洛貝林的應用過程中應該嚴格控制劑量的大小，因為洛貝林在使用劑量增大的同時，對大腦皮質、迷走神經中樞等的作用也隨之增大，不良反應也會增加，癥狀嚴重的可引起驚厥[注]Da C E S L， Rodrigues L C， Dos Santos V R， et al. Evaluation of mutagenic and genotoxic activities of lobeline and its modulation on genomic instability induced by ethanol.[J]. Life Sciences， 2014， 103(2):73-78.。

Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O是一種新型3D多孔MOFs材料，本課題組前期已對其進行吸附N2、Ar2和多種有機分子的研究，但尚未見文獻報道其作為藥物載體的研究。據此，本文采用洛貝林為模型藥物，采用兩因素優(yōu)化載藥制備工藝，考察了載藥Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的體外釋藥特性及體外細胞毒性實驗，為其作為藥物載體的開發(fā)應用提供了依據。

一、實驗部分

(一)所用儀器

紅外光譜測試儀器(Nicolet Impact 410 FT-IR紅外儀)；粉末XRD測定儀器(Siemens D5005 型X-射線衍射儀)；單晶衍射數據(Rigaku/MSC Mercury CCD單晶衍射儀)；熱失重(TGA)測定(TGA/SDTA851e 熱解重量分析儀)；熒光光譜測定儀器(Perkin-Elmer LS55型熒光光譜儀)；HEPA Class 100 CO2培養(yǎng)箱( Thermo電子公司) ，振蕩恒溫器(SPX-100B-D，上海薄迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠) ; 高溫恒溫試驗箱( GHX-30，無錫科隆實驗設備有限公司)。

(二)合成金屬有機框架Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O

1.合成配體(E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯(C16H10N2O8)

圖1 (E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯(C16H10N2O8)結構圖

圖2 (E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯(C16H10N2O8)合成路線

將200mL 濃硫酸倒進400ml燒瓶，0℃冰水浴下，邊攪拌邊加入100ml發(fā)煙硝酸。然后將分小份加入10g對氯甲基苯甲酸，反應90分鐘后對氯甲基苯甲酸完全溶于混酸，將瓶中所有物體倒入600ml冰水中，析出大量白色固體。過濾并洗滌殘留混酸，所的物于甲苯溶劑中重結晶。得到化合物3-硝基對氯甲基苯甲酸白色晶體，烘箱烘干收集(89%)。

50ml無水乙醇倒進300ml燒杯，將5.7g(0.0970mol)KOH溶解于無水乙醇。接著倒入5.00g(0.0230mol)3-硝基對氯甲基苯甲酸，生成棕色沉淀，為(E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯的鉀鹽。室溫反應45min后真空抽濾并把所得固體于70ml水中溶解。加HCl于該水溶液到pH=1并形成沉淀。收集固體，用四氫呋喃溶劑重結晶，黃色晶體(E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯(C16H10N2O8)化合物獲得，烘箱烘干收集(78%)。

2.合成化合物Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O

把配體(E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯(C16H10N2O8)(0.15mmol)、4,4’-聯(lián)吡啶(BPY，0.15mmol)、硝酸鋅(Zn(NO3)2·6H2O，0.15mmol)、乙醇2ml、H2O 10ml放到50ml高壓反應釜里，調pH為9，超聲， 150℃兩天。過濾并洗滌后可獲得菱形黃色晶體(E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯。元素分析：C 52.45, N 9.34,H 3.11, Zn 10.89%；理論值：C 52.37, N 9.40,H 3.02, Zn 10.98%。該產物組成為： C26H18N4O9Zn(595.81)。

(三)測定結構

用Bruker Smart-1000 CCD 單晶X射線衍射分析儀對Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O單晶數據進行測試。晶體結構解析和結構精修是 SHELXTL 軟件。Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的主要晶體學數據列詳見下表。

表1 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的晶體學數據和結構修正條件

(四)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O載入洛貝林

1.繪制標準曲線

準確稱適量洛貝林，以甲醇溶劑配制溶液。用溶劑作空白，波長掃描尋找最大吸收峰為249nm。然后配制標準溶液濃度梯度，建立在此波長處的吸光度(A)和濃度(c)的標準曲線。該標準曲線適用于載藥環(huán)境。

與上述操作同，以pH=7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)為溶劑配制適宜濃度洛貝林溶液，以PBS為空白對照，建立吸光度(A)和濃度(c)的標準曲線。該標準曲線適用于釋藥環(huán)境。

2.洛貝林載入

準確稱取干燥活化后的Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 2mg，加入含有10mg洛貝林的1mL甲醇溶液中，超聲混勻，作用24h，離心反應液(10000rpm，10min)，取上清液 100 μl ，稀釋到 10mL(100 倍)，測其 249 nm 下吸光度，并計算 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 載藥量。

載藥量 = (MOFs內藥量/MOFs總質量)×100%

(五)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O體外釋放洛貝林性能測定

取 2 mg 裝載有洛貝林的Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O，放到20 mL PBS 緩沖溶液里，此為實驗組。另取 1.16 mg Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O，放到 20 mL PBS緩沖液中，此為空白組。在(37±1℃)恒溫振蕩器中(振蕩速度 100r.min-1)，每間隔12h取1mL 溶液并加入等量新鮮 PBS 緩沖液，將取出的溶液離心操作(12000rpm, 20min)后，取上清液用紫外光譜測定其吸光度，根據所建立的洛貝林標曲計算溶液中洛貝林含量，繪制累積釋放量與時間關系曲線，考察載藥后的Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O體外釋放洛貝林性能。

(六)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O細胞毒性實驗

采用含10% 的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液來培養(yǎng)Hela細胞，取用處于對數生長期、生長狀態(tài)好的Hela細胞，并用0.25% 的胰蛋白酶消化細胞，離心操作使細胞沉淀，用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液配制細胞懸浮液，細胞密度1×105個·mL-1，以每孔104個細胞接種到96孔培養(yǎng)板里(6個復孔)，每孔100μL，把培養(yǎng)板轉移到培養(yǎng)箱，37℃、5% CO2以及飽和濕度條件下培養(yǎng)24h后更換100μL RPMI1640培養(yǎng)液。實驗分3組:空白對照(不加細胞)、陰性對照(細胞，不加Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O)、Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O(加細胞，加Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O)。加入各組藥液各100μL，使質量濃度分別為200，100，50，25，12，6μg·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔更換100μL RPMI 1640培養(yǎng)液，加20μL MTT 溶液(5mg·mL-1)，微量振蕩器上振蕩20 min，繼續(xù)培養(yǎng)24h，除掉培養(yǎng)液，每孔加150μL DMSO，酶聯(lián)免疫檢測測定于490nm 處的吸光度(A)，可計算細胞存活率[注]Li, B. Y.; Zhang, Z. J.; Li, Y., et al., Enhanced Binding Affinity, Remarkable Selectivity, and High Capacity of CO2 by Dual Functionalization of a rht-Type Metal-Organic Framework [J]. Angew Chem Int Edit 2012, 51(6): 1412-1415.。

存活率%=(藥物組-空白組)/(陰性對照組-空白組)×100%

二、性質研究與結果和討論

(一)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O晶體結構

X射線單晶結構測試結果表明Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O晶體為三斜晶系、P-1空間群，其次級構筑單元中含有兩個Zn(Ⅱ)離子和兩個配體(E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯，還有兩個配體聯(lián)吡啶。圖3表示了Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的金屬配位環(huán)境。從中能看出，Zn1與Zn2分別采用6配位形式，與之配位的四個氧配位原子分別出自于兩個雙齒螯合結構的羧基氧原子與兩個水分子；與之配位的兩個氮配位原子則分別出自兩個配體聯(lián)吡啶。

圖3可看出，沿ac平面方向，單個配體(E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯與兩個Zn(Ⅱ)離子配位，而每個Zn(Ⅱ)離子還與一個水分子中氧配位原子和兩個配體(E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯配位，從而向外延伸構成2D平面。沿c軸方向，層和層間又經由聯(lián)吡啶柱配體同Zn(Ⅱ)離子配位連接從而搭建3D網狀結構，最終形成具有一維孔道結構的3D金屬-有機框架材料(圖3-4、圖3-5、圖3-6)。

圖3 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O次級構筑單元

圖4 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 2D層結構

圖5 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的三維結構圖

圖6 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的框架結構圖

(二)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O紅外吸收譜圖

圖7 (E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯配體(右)與Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O(左)的紅外吸收譜圖比較

(E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯配體與Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的紅外吸收光譜如圖7，其1598cm-1處吸收峰來自于苯環(huán)C=C震動，1500cm-1處吸收峰則屬于-NO2基團的對稱伸縮，1660cm-1處吸收峰則是c=c雙鍵伸縮振動，810cm-1左右處吸收峰是吡啶環(huán)的C…H檢形變振動，據此可證明配體(E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯同配體聯(lián)吡啶配位成功。

(三)顯微鏡與SEM表征Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O

利用顯微鏡和SEM，對Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O形貌進行表征。圖8是Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的顯微鏡圖，可看出晶體Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O呈黃色菱形晶體。而圖9是Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 在SEM的表面形貌，可看出Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O表面結構呈魚鱗狀。

圖8 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O顯微鏡表征

圖9 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2OSEM表征

(四)熒光表征

Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O熒光發(fā)射光譜如圖10。300nm波長激發(fā)時，Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O于383nm位置有一發(fā)射信號。

圖10 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的熒光發(fā)射表征

(五)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O粉末XRD表征

圖11 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的粉末XRD表征

圖11是Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的實測和軟件模擬及配體三者的粉末XRD結果。其中A圖是配體聯(lián)吡啶XRD，B圖是配體(E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯XRD，C圖是Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O實測粉末XRD，D圖則是Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的模擬XRD。從圖可看出，Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O實測值與軟件模擬值能很好吻合，由此表明此化合物為純相，且同兩配體具有有明顯差異。

(六)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O熱分析表征

在0℃到600℃溫度范圍氮氣環(huán)境下對Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O進行了DSC-TG熱重分析。圖12是Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的DSC-TG圖。從圖中可知，Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O可穩(wěn)定至350℃。Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O在50-200℃溫度范圍發(fā)生第一次熱失重，失重3.78%(理論值3.65%)，可歸因于失去客體分子。而在350℃-560℃溫度范圍發(fā)生結構坍塌從而失重46.58%(理論值45.45%)，最終剩余物49.15%(理論值48.78%)主要成分ZnO。

圖12 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的DSC-TG分析結果

(七)載藥緩釋研究

1.Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O載藥量測定

通過測量發(fā)現洛貝林甲醇溶液最大吸收峰在 249 nm 處。

表2 給出了洛貝林與載體質量之比以及載藥時間對Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O所載藥物量之間的關系?？煽闯?，隨著洛貝林與載體質量之比的增加(固定載體質量，增加藥物質量)，Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O載藥量隨之加大；作用時間的延長同樣能使Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O載藥量加大．但在不同藥物與載體質量比之下，Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O最高載藥量構出現于第5天，由此說明吸附作用在第5天時，Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O裝載的藥物量已經達到飽和，載藥量到達最大值。而當作用時間延長到7天的時候，載藥量反而有所下降，這有可能是吸附于Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O表面的部分藥物由于浸泡時間過長而發(fā)生的脫落所導致，由此說明最佳的作用時間是5天。由表2 可知，最佳實驗組條件為藥物與載體質量比為5∶1，作用時間為5天，可得到的最高載藥量為0.355 g/g載體。

表2 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O(m1)裝載洛貝林(m2)的載藥量(n=3)

2.Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O裝載洛貝林的體外釋藥

如圖13所示，釋藥曲線的前半部分比較陡直，釋藥過程分為兩個過程，最初的 12小時表現為突釋的特性，洛貝林的突釋量在12小時之內為29.2%，這主要是由于吸附于 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O表面的洛貝林擴散進入介質而造成的，隨后則進入平穩(wěn)的緩慢釋放階段，吸附于Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 孔道中的洛貝林慢慢被釋放出來。平穩(wěn)釋放72小時內，洛貝林釋放量達到 64.15%，而在平穩(wěn)釋放7天之內，洛貝林的釋放量則達到75.23%，顯示出明顯的緩釋效果。

圖13 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O裝載洛貝林體外釋藥曲線

3.Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 細胞毒性實驗結果

本實驗用正常生長細胞(Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 質量濃度為0μg·mL-1) 做為陰性對照組，用Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O作為藥物組，分別作用于Hela 細胞以此研究Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的細胞體外毒性。細胞體外毒性實驗結果顯示，不同濃度的Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 作用于Hela 細胞36小時之后，隨Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O質量濃度的加大，細胞存活率呈現出下降趨勢，當Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O質量濃度小于20μg·mL-1的時候，細胞存活率高，與對照組比較 P>0.05，而當Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O質量濃度大于20μg·mL-1的時候，細胞存活率隨Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 質量濃度的增大二下降趨勢變得明顯，在Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O質量濃度是250μg·mL-1時候，細胞存活率達到最低值。

綜上，采用溶劑熱法可經由配體(E)-二(對3-硝基苯甲酸)乙烯(C16H10N2O8)合成新型金屬有機框架材料Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O；用干燥活化處理以后的Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O載入洛貝林，具有較高的載藥量，釋藥曲線顯示出Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O具有緩釋功能，可延長洛貝林的作用時間，同時降低其副作用；而且Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O具有良好的生物相容性，有望成為優(yōu)良的藥物載體。