王豪，涂宗財(cái),*，羅亞林，王輝，葉云花，張露，沙小梅，謝雅雯

1(江西師范大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院江西省淡水魚(yú)高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌，330022) 2(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南昌大學(xué))，江西 南昌，330047)

活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是人體代謝的正常產(chǎn)物，參與細(xì)胞信號(hào)傳遞、細(xì)胞凋亡等代謝途徑[1-2]，但自由基的過(guò)量積累可以造成生物膜系統(tǒng)損傷以及細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化障礙，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、DNA和脂肪等生物大分子的氧化損傷[3-4]，對(duì)身體健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，如引發(fā)心血管疾病、糖尿病、衰老、老年癡呆等多種慢性疾病[5-6]。預(yù)防和治療氧化損傷引起的各種慢性疾病的有效方法之一是利用抗氧化劑清除人體中過(guò)多的活性氧自由基，包括合成和天然的抗氧化劑。目前，合成抗氧化劑如叔丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)和沒(méi)食子酸丙酯(PG)等主要作為食品添加劑用于延緩食品氧化變質(zhì)、提高食品穩(wěn)定性等[7-8]，暫無(wú)可用于臨床治療的合成抗氧化劑。因此，從天然食物資源(蔬菜、水果、谷物、堅(jiān)果等)中篩選安全、有效的清除ROS的活性成分，對(duì)促進(jìn)人體健康，延緩人體衰老具有重要意義。

堅(jiān)果是膳食纖維、礦質(zhì)元素、多不飽和脂肪酸、維生素和抗氧化劑等的優(yōu)質(zhì)來(lái)源，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、飽腹感強(qiáng)、保健效果好等特點(diǎn)日益成為備受推崇的主流健康休閑食品。目前已有大量關(guān)于堅(jiān)果生物活性方面的研究報(bào)道，如YANG等[9]表明，核桃多酚可以影響自由基、抗氧化酶和脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，從而提高小鼠脾淋巴細(xì)胞的免疫功能。黎章矩等[10]研究表明，香榧子提取物能預(yù)防小鼠動(dòng)脈粥樣硬化。LIU等[11]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)脫毒銀杏果粉(DGP)可以減輕炎癥并促進(jìn)正常的脂質(zhì)代謝。劉志彬等[12]研究表明，巴旦木和巴旦木皮具有改善人體血脂狀況，提高機(jī)體抗氧化的能力。當(dāng)前最受歡迎的堅(jiān)果類產(chǎn)品有核桃、銀杏果、葵花籽、松子、開(kāi)心果等，但不同的堅(jiān)果產(chǎn)品，其市售價(jià)也相差很大，如香榧(Torreyagrandiscv.merrillii)果仁的售價(jià)通常在150～250元/斤，遠(yuǎn)高于核桃(JuglansregiaL.)、巴旦木(almonds)、銀杏果(GinkgobilobaL. seed)、花生(ArachishypogaeaLinn.)和葵花籽(HelianthusannuusL. seed)等常見(jiàn)堅(jiān)果，而核桃和巴旦木的售價(jià)遠(yuǎn)高于花生和葵花籽。不同堅(jiān)果中活性成分的含量和抗氧化活性是否與其價(jià)格成正比這一科學(xué)問(wèn)題還不明確。

因此，本文以總黃酮、總酚和總?cè)坪繛樵u(píng)價(jià)指標(biāo)，以核桃、巴旦木、銀杏果、花生、葵花籽、野生和種植香榧仁為研究對(duì)象，對(duì)比其提取物中活性成分含量差異，同時(shí)通過(guò)分析提取物的DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力和鐵離子還原能力，評(píng)價(jià)7種堅(jiān)果仁提取物的抗氧化活性，以期為堅(jiān)果營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)價(jià)提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

種植香榧采自浙江諸縣，野生香榧采自江西黎川巖泉自然保護(hù)區(qū)，烘干未經(jīng)任何調(diào)味的核桃、巴旦木、銀杏果、花生、葵花籽，采購(gòu)于江西省南昌市天虹超市；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；Folin-Ciocalteu試劑、AlCl3、沒(méi)食子酸(gallic acid equivalent, GAE)、槲皮素(quercetin equivalent, QuE)、蘆丁等其他試劑，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DFY-500高速中藥粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；DUG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，SXL-1008程控箱式電爐，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KDY-9820凱氏定氮儀，北京市通潤(rùn)源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司；R404A冷凍離心機(jī)，上海艾本德生物技術(shù)國(guó)際貿(mào)易有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；LGJ-1D-80冷凍干燥機(jī)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；Synergy H1多功能微孔板檢測(cè)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

對(duì)堅(jiān)果樣品去殼處理后，測(cè)定其水分、灰分、蛋白含量和脂肪含量。水分測(cè)定參照國(guó)標(biāo)《GB5009.3—2016》，灰分測(cè)定參照國(guó)標(biāo)《GB 5009.4—2010》，蛋白含量參照國(guó)標(biāo)《GB50095》，脂肪含量的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)《GB5009.6—2016》。

1.3.2 活性成分提取

所有堅(jiān)果樣品去殼后，采用粉碎機(jī)將堅(jiān)果仁粉碎，然后采用超聲波輔助提取法提取其中的活性成分。準(zhǔn)確稱取5.0 g堅(jiān)果粉末與50 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇混合，500 W，50 ℃超聲處理1 h后，7 000 r/min離心7 min，收集上清液，殘?jiān)僭谙嗤瑮l件下提取2次，合并所有上清液，減壓濃縮除去乙醇后再冷凍干燥。最后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇配成10 mg/mL的溶液用于后續(xù)分析。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

1.3.3 總黃酮含量測(cè)定

參照前期實(shí)驗(yàn)步驟，采用NaNO2-AlCl3-NaOH法[13]測(cè)提取物中的總黃酮含量，用蒸餾水代替10% AlCl3的反應(yīng)體系為空白。以槲皮素(50～300 μg/mL)為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中的總黃酮含量用毫克槲皮素當(dāng)量每克干原料(mg QuE/g DM)表示。重復(fù)測(cè)3次，取平均值。

1.3.4 總酚含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定提取物中的總酚含量[14]，用0.3 mL蒸餾水代替200 g/L的Na2CO3的反應(yīng)體系為樣品空白，以沒(méi)食子酸(20～100 μg/mL)為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中的總酚含量用毫克沒(méi)食子酸每克干原料當(dāng)量(mg GAE/g DM)表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 總?cè)坪康臏y(cè)定

根據(jù)張露等[14]的方法測(cè)定樣品中總?cè)频暮俊?00 μL適宜濃度的樣品與0.5 mL 50 g/L的香草醛—冰醋酸和1.0 mL高氯酸混合并于60 ℃ 反應(yīng)20 min，冰水冷卻15 min后加入3.0 mL冰醋酸，室溫反應(yīng)10 min，最后測(cè)定樣品在547 nm下的吸光值，用冰醋酸代替質(zhì)量濃度50 g/L香草醛-冰醋酸的溶液為空白。以齊墩果酸(20～100 μg/mL)為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中的總?cè)坪坑煤量她R墩果酸(oleanolic acid equivalent, OAE)當(dāng)量每克干原料(mg OAE/g DM)表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.6 DPPH·清除能力

參照FU等[15]的方法比較7種堅(jiān)果提取物清除DPPH·的能力。50 μL樣品與150 μL 0.15 mmol/L DPPH·溶液于室溫避光反應(yīng)30 min，然后采用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)體系在517 nm的吸光值，以甲醇代替DPPH·溶液的反應(yīng)體系為樣品空白，分別以70%乙醇和甲醇代替樣品和DPPH·溶液的反應(yīng)體系為空白，計(jì)算DPPH·清除能力，樣品的DPPH·清除能力用IC50值(半抑制濃度，即樣品清除自由基的能力達(dá)到50%時(shí)所需的提取物濃度)表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 ABTS+·清除能力

采用ABTS+·清除能力實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)7種堅(jiān)果提取物的總抗氧化能力[16]。首先配制5 mL含有19.2 mg ABTS和3.317 mg過(guò)硫酸鉀的ABTS+·儲(chǔ)存液，室溫避光反應(yīng)12～16 h，使用前用甲醇稀釋至溶液在734 nm處的吸光值為0.7±0.2。分別取30 μL適宜濃度的樣品與170 μL ABTS+·溶液于96孔酶標(biāo)板中混合，避光反應(yīng)6 min后于734 nm測(cè)吸光值。以甲醇代替ABTS+·溶液的反應(yīng)體系為樣品空白，分別以70%乙醇和甲醇代替樣品和ABTS+·溶液的反應(yīng)體系為空白，計(jì)算ABTS+·清除能力，樣品的ABTS+·消除能力用IC50值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.8 Fe3+還原能力分析

參照AKBARI等[17]的方法比較7種堅(jiān)果提取物的Fe3+還原能力。向0.2 mL不同濃度樣品中加入0.3 mL 10 g/L的K3[Fe(CN)6]溶液，50 ℃反應(yīng)20 min后加入0.3 mL 100 g/L的三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入0.6 mL蒸餾水和0.15 mL 1 g/L的FeCl3，搖勻后于700 nm處測(cè)吸光值，吸光度越高，表示樣品的還原能力越強(qiáng)。用0.15 mL蒸餾水代替1 g/L的FeCl3作為樣品空白，以槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照，樣品的Fe3+還原能力用毫克槲皮素當(dāng)量每克提取物表示(mg QuE/g E.)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3遍，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，利用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)間的顯著性差異，P<0.05則認(rèn)為樣品間具有顯著性差異。IC50值為樣品清除50%的自由基所需要的提取物濃度(mg E./mL)，采用Origin 8軟件中的多項(xiàng)擬合計(jì)算樣品清除DPPH·和ABTS+·的IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定結(jié)果

7種堅(jiān)果仁中主要營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定結(jié)果如表1所示。由表1可知，7種堅(jiān)果仁的水分含量相差較大，其中以葵花籽為最低，其水分含量為3.48%，而銀杏果則高達(dá)19.41%。不同堅(jiān)果仁的灰分差異不大，為1.95%～3.57%。蛋白質(zhì)含量中，葵花籽含量最高，為3.05 g/100g，野生香榧的蛋白質(zhì)含量最低，為1.04 g/100g。7種堅(jiān)果仁樣品中，核桃的脂肪含量最高(3.40 g/100g)，而銀杏的脂肪含量最低(0.54 g/100g)。

表1 七種堅(jiān)果仁主要營(yíng)養(yǎng)成分含量Table 1 The content of main nutrition components in seven nut samples

2.2 總黃酮含量分析

7種堅(jiān)果中的總黃酮含量如表2所示。不同堅(jiān)果中的總黃酮含量差異明顯(P<0.05)，葵花籽仁具有最高的總黃酮含量，其含量高達(dá)35.16 mg QuE/g DM，其次為種植香榧(15.17 mg QuE/g DM)，銀杏果中的總黃酮含量最低，僅為1.36 mg QuE/g DM。野生香榧中的總黃酮含量遠(yuǎn)低于種植香榧，為2.98 mg QuE/g DM，只有種植香榧的19.6%。李鈞敏等[18]報(bào)道長(zhǎng)葉榧種子中總黃酮含量為1.06～2.65 mg/g；ZHANG等[19-20]研究表明江西種植香榧仁中的總黃酮含量為0.17 mg QuE/gDM，不同的總黃酮含量可能是由于樣品的品種、生長(zhǎng)環(huán)境、采集季節(jié)的差異以及含量測(cè)定方法的不同所引起。但總體上可以得出，種植香榧中的總黃酮含量高于野生香榧，以及銀杏果、巴旦木、花生和葵花籽仁。

表2 七種堅(jiān)果中總黃酮、總酚和總?cè)坪縏able 2 Total flavonoids, total phenolics and total triterpenoids content in seven nut samples

注：同一列右上角的相同字母(a、b、c等)代表樣品間的數(shù)值不存在顯著性差異(P> 0.05)。

2.3 總酚含量分析

7種堅(jiān)果中的總酚含量如表2所示，不同堅(jiān)果中的總酚含量變化差異與總黃酮的不同，7種測(cè)試堅(jiān)果中總酚含量的變化趨勢(shì)為：核桃>種植香榧>葵花籽>花生>野生香榧>銀杏果>巴旦木。核桃中的總酚含量最高，為9.69 mg GAE/g DM，種植香榧的總酚含量次之，為8.99 mg GAE/g DM，巴旦木的總酚含量最低，僅為核桃的3.63%。與總黃酮含量相同，野生香榧中的總酚含量遠(yuǎn)低于種植香榧，僅為后者的23.9%。

2.4 總?cè)坪糠治?/h3>

由表2可知，不同堅(jiān)果的總?cè)坪看嬖诓町愋?，種植香榧具有最高的總?cè)坪浚瑸?.37 mg OAE/g DM，目前已從香榧子中鑒定的萜類化合物有g(shù)randione[19]、β-谷甾醇、紫杉醇和胡蘿卜苷[20]。核桃仁中總?cè)坪績(jī)H次于種植香榧(2.47 mg OAE/g DM)；銀杏果中的總?cè)坪孔畹?，?.57 mg OAE/g DM，只有種植香榧的13%。葵花籽和花生的總?cè)坪坎淮嬖陲@著性差異(P>0.05)，分別為1.45 mg OAE/g DM和1.49 mg OAE/g DM。

2.5 抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.5.1 DPPH·清除能力

采用DPPH·清除能力實(shí)驗(yàn)比較不同堅(jiān)果提取物的體外抗氧化性能力，結(jié)果見(jiàn)圖1，其IC50值見(jiàn)表3。

圖1 七種堅(jiān)果提取物的DPPH·清除能力Fig.1 DPPH· scavenging ability of seven nut extracts

表3 七種堅(jiān)果提取物的DPPH·和ABTS+·清除能力的IC50值和槲皮素當(dāng)量還原能力Table 3 The IC50 values of DPPH· and ABTS+·scavenging ability and quercetin equivalent reducing ability of seven different nut samples

注：*表示該數(shù)值用μg/mL表示；Q-槲皮素；同一列右上標(biāo)的不同字母(a、b、c等)表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異(P<0.05)。

在測(cè)試濃度(0.05～10 mg DM/mL)，種植香榧、核桃、葵花籽和花生仁均具有較好的DPPH·清除能力，且其活性均隨樣品濃度的增加逐漸增加，而野生香榧、巴旦木和銀杏果的DPPH·清除能力較弱，當(dāng)樣品濃度大于2 mgE./mL時(shí)才具有明顯的量效關(guān)系。7種堅(jiān)果提取物的DPPH·清除能力均低于陽(yáng)性對(duì)照(IC50值為0.01 mg E./mL)，但是相對(duì)于其他樣品，種植香榧表現(xiàn)出了最高的DPPH·清除能力，其IC50值為0.08 mg DM/mL，其次為核桃(0.14 mg E./mL)，銀杏果清除DPPH·的能力最低，其IC50值(11.45 mg E./mL)約為種植香榧葉的143倍。同時(shí)，野生香榧提取物清除DPPH·的能力遠(yuǎn)低于種植香榧，其IC50值約為種植香榧的68.5倍。樣品的DPPH·清除能力變化趨勢(shì)與其總酚含量相似，因此種植香榧和核桃提取物中較高的DPPH·清除能力可能是由于其較高的總酚含量所致。植物提取物中總酚含量的高低對(duì)DPPH·清除能力具有顯著的影響，這一現(xiàn)象在多項(xiàng)研究中被發(fā)現(xiàn)，CALLI等[21]以DPPH·清除能力為導(dǎo)向，從核桃仁提取物中分離鑒定了香草酸、沒(méi)食子酸、原兒茶酸等7個(gè)酚類化合物。ZHAO等[22]對(duì)蘭花忍冬(LoniceracaeruleaL.)不同極性溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，樣品的DPPH·清除能力的強(qiáng)弱與總酚含量完全一致，即總酚含量越高，DPPH·清除能力也越強(qiáng)。ILAIYARAJA等[23]在對(duì)象橘(Feronialimonia)生物活性成分的提取條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，DPPH·清除能力與總酚含量的改變是呈正相關(guān)的。

2.5.2 ABTS+·清除能力

采用ABTS+·清除能力試驗(yàn)比較不同堅(jiān)果提取物的總抗氧化活性，結(jié)果如圖2所示，其IC50值如表3所示。

圖2 七種堅(jiān)果提取物的ABTS+·清除能力Fig.2 ABTS+· scavenging ability of seven nut extracts

由圖2和表3結(jié)果可知，樣品的ABTS+·清除能力的變化趨勢(shì)總體上與其DPPH·清除能力相似，當(dāng)百分清除率低于90%時(shí)，所有樣品的ABTS+·清除能力均表現(xiàn)出良好的劑量關(guān)系。不同堅(jiān)果提取物清除ABTS+·的IC50值的變化趨勢(shì)為：核桃(0.07 mg E./mL)≈種植香榧(0.07 mg E./mL)<葵花籽(0.22 mg E./mL)<花生(0.43 mg E./mL)<銀杏果(0.92 mg E./mL)≈野生香榧(0.98 mg E./mL)<巴旦木(2.02 mg E./mL)。核桃和種植香榧具有最高的ABTS+·清除能力，且兩者之間不存在顯著性差異(P>0.05)，野生香榧和銀杏果的ABTS+·清除能力也不存在顯著性差異(P>0.05)。 前期研究也表明，核桃提取物[24]和香榧仁提取物[14]具有較高的ABTS+·清除能力。巴旦木的ABTS+·清除能力最低，其IC50值為核桃和種植香榧的28.9倍，但所有樣品的ABTS+·清除能力均低于陽(yáng)性對(duì)照品槲皮素。

2.5.3 Fe3+還原能力

不同堅(jiān)果提取物的Fe3+還原能力如圖3所示，其槲皮素當(dāng)量還原能力(mg QuE/g E.)如表3所示。

圖3 七種堅(jiān)果提取物的Fe3+還原能力Fig.3 Fe3+ reducing ability of extracts from seven nut extracts

當(dāng)樣品濃度為0.3～2.4 mg E./mL時(shí)，核桃、種植香榧和葵花籽提取物的還原能力隨樣品濃度的增加呈明顯的量效關(guān)系，而巴旦木、花生和野生香榧提取物的還原能力隨樣品濃度的提高增加不明顯，其在700 nm處的吸光值僅由0.018增加到0.254。核桃提取物具有最高的Fe3+還原能力，其次為種植香榧，其槲皮素當(dāng)量值分別為115.25和54.60 mg QuE/g E.。銀杏果提取物的還原能力最弱，當(dāng)樣品濃度為0.475～2.375 mg E./mL時(shí)，其還原能力不隨樣品濃度的增加逐漸增加，700 nm處的吸光值僅由0.036增加到0.086。野生香榧提取物的Fe3+還原能力與銀杏果提取物沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，其Fe3+還原能力同樣弱于其他5種堅(jiān)果提取物，其槲皮素當(dāng)量值為0.49 mg QuE/g E.，約為核桃和種植香榧的1/235 和1/111。由此可見(jiàn)，種植香榧是一種較好的天然還原劑。

3 結(jié)論

本文首次將核桃、巴旦木、銀杏果、花生、葵花籽、野生和種植香榧等常見(jiàn)堅(jiān)果進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其活性成分含量及其抗氧化能力。研究結(jié)果表明，葵花籽中的總黃酮含量最高；核桃仁有最高的總酚含量，而種植香榧具有最高的總?cè)坪??；钚苑治鲲@示，核桃和種植香榧提取物的體外抗氧化能力顯著高于巴旦木、銀杏果、花生、葵花籽和野生香榧，其中種植香榧提取物具有最高的DPPH·和ABTS+·清除能力，而核桃提取物的Fe3+還原能力最強(qiáng)，其次為種植香榧。因此，種植香榧是優(yōu)于巴旦木、銀杏果、花生、葵花籽和野生香榧的天然抗氧化劑資源，測(cè)試7種堅(jiān)果的售價(jià)與其活性成分含量和生物活性不具有明顯的正向關(guān)系。本文可為人們選擇適合的堅(jiān)果提供參考。