王凌云，鄧尚貴*，李鈺金，霍健聰，謝卓宣，徐燕娟

1(浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山，316000)2(山東泰祥食品股份有限公司，山東 榮成，264300)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)屬甲殼綱，為一種生活在南大洋海域的高等浮游甲殼動物。南極磷蝦營養(yǎng)價(jià)值高，但由于南極磷蝦體內(nèi)自溶酶活性高，捕撈后極易自溶，鮮銷時(shí)需要完善的冷鏈保存。因此，開發(fā)南極磷蝦蛋白資源的新的利用途徑成為當(dāng)務(wù)之急。

蛋白粉是目前深受消費(fèi)者歡迎的營養(yǎng)保健品，南極磷蝦蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量低，且富含多種礦物質(zhì)，屬優(yōu)質(zhì)動物蛋白資源，是生產(chǎn)蛋白粉的優(yōu)質(zhì)原料。目前，國內(nèi)南極磷蝦蛋白的加工和利用研究剛剛起步[1-4]，關(guān)于南極磷蝦蛋白粉的研究報(bào)道基本處于一片空白。本研究小組采用木瓜蛋白酶對南極磷蝦進(jìn)行酶解，制備南極磷蝦蛋白液，利用噴霧干燥制備南極磷蝦蛋白粉，并對蛋白粉進(jìn)行營養(yǎng)評價(jià)，為這類資源的高值化開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

南極磷蝦(于2018年1日捕獲)，山東泰祥食品有限公司提供。冷凍南極磷蝦于2018年3月6日在冷凍條件下運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，于-60 ℃條件下貯存。

木瓜蛋白酶(2×105U/g)，購于廣西南寧龐博生物工程有限公司；化學(xué)試劑及分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品等均購于國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司(分析純)。

液相色譜儀(安捷倫 1260)，美國安捷倫科技公司；氨基酸自動分析儀(L-8900)，天美科學(xué)儀器有限公司；原子吸收分光光度計(jì)(TAS-990)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；色差儀(WF32)，上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司；紫外可見分光光度計(jì)(UV-2600)，上海皖寧精密科學(xué)儀器有限公司；噴霧干燥機(jī)(SD-1000)， 日本東京理化；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(A-1000S)，日本東京理化；其余均為實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程

冷凍南極磷蝦→解凍→稱量→加水勻漿→恒溫酶解→滅酶(100 ℃，15 min)→

1.2.2 酶解條件單因素試驗(yàn)[5]

南極磷蝦原料，南極磷蝦于實(shí)驗(yàn)前一日從超低溫冰箱中取出，置于普通冰箱冷藏室內(nèi)自然解凍，實(shí)驗(yàn)前用濾紙吸干表面水分，采用食物攪拌機(jī)攪碎后制得南極磷蝦肉糜。南極磷蝦酶解用酶，考慮到木瓜蛋白酶資源豐富，價(jià)格低廉，且水解能力好等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選擇木瓜蛋白酶進(jìn)行水解。取經(jīng)攪碎后的南極磷蝦肉糜15 g置于燒杯中，加入適量蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值，加入適當(dāng)比例的木瓜蛋白酶，用水浴鍋升至合適溫度，并在此溫度下保溫酶解。酶解結(jié)束后升至100 ℃， 保溫15 min后滅酶，離心取上清液，進(jìn)行超濾分離，測定蛋白酶水解度。具體酶解條件如下。

料液比：在加酶量為3 000 U/g，酶解溫度55 ℃， pH 6.5時(shí)，設(shè)料液比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，在此條件下恒溫水浴2 h。

加酶量：在酶解溫度55 ℃，pH 6.5，料液比為1∶2 時(shí)，設(shè)加酶量分別為600、1 800、3 000、4 200、5 400 U/g， 在此條件下恒溫水浴2 h。

溫度：在加酶量為3 000 U/g，pH 6.5時(shí)，料液比為1∶2時(shí)，設(shè)水浴加熱溫度分別為45、50、55、60、65 ℃。 在此條件下恒溫水浴2 h。

pH值：在加酶量為3 000 U/g，酶解溫度55 ℃，料液比為1∶2時(shí)，設(shè)pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0， 在此條件下恒溫水浴2 h。

酶解時(shí)間：在加酶量為3 000 U/g，酶解溫度55 ℃， 料液比為1∶2時(shí)，pH值6.5時(shí)，設(shè)水浴加熱時(shí)間分別為0.5、1、2、4、6 h。

1.2.3 南極磷蝦水解度的測定[6]

待南極磷蝦酶解結(jié)束，將酶解液離心，取上清液并進(jìn)行超濾，得到酶解液。用甲醛滴法測定上清液氨基酸含量，代入式(1)計(jì)算水解度(DH)。

(1)

1.2.4 酶解物分子質(zhì)量排布測定

酶解物分子質(zhì)量排布測定采用凝膠過濾色譜法。稱取一定量南極磷蝦酶解物用流動相溶解，在0.45 μm膜過濾后上柱記錄出峰時(shí)間，求其相對分子質(zhì)量[7]。層析條件:色譜柱(TSK gel 2500 PWXL 300 mm×7.8 mm)，柱溫40 ℃，流速0.5 mL/min，在波長220 nm下測定。

1.2.5 南極磷蝦蛋白粉噴霧干燥工藝[8]

首先將南極磷蝦酶解液在真空濃度為0.95 MPa，轉(zhuǎn)速5 000 r/min條件下進(jìn)行真空濃縮。濃縮結(jié)束后的酶解液噴霧干燥，每次干燥處理料液量1 500 mL。

進(jìn)料濃度：進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃，進(jìn)料溫度30 ℃，進(jìn)料速度12 mL/min，出風(fēng)溫度80 ℃條件下，分別選用進(jìn)料液蛋白質(zhì)量濃度為100、150、200、250 g/L的料液噴霧干燥。

進(jìn)風(fēng)溫度：在進(jìn)料液蛋白質(zhì)量濃度為250 g/L，進(jìn)料溫度30 ℃，進(jìn)料速度12 mL/min，出風(fēng)溫度80 ℃條件下，分別選用160，170，180，190和200 ℃作為進(jìn)風(fēng)溫度。

進(jìn)料速度：選用進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃，進(jìn)料液蛋白質(zhì)量濃度250 g/L，進(jìn)料溫度30 ℃，出風(fēng)溫度80 ℃條件下，進(jìn)料速度分別采用6，8，10，12和14 mL/min。

進(jìn)料溫度：選用進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃，進(jìn)料液蛋白質(zhì)量濃度250 g/L，進(jìn)料速度12 mL/min，出風(fēng)溫度80 ℃， 選取進(jìn)料溫度分別30，40，50和60 ℃。

1.2.6 堆積密度及溶解度的測定

堆積密度測定[9]：將蛋白粉從漏斗中撒落至干燥的10 mL量筒(量筒質(zhì)量記為m1)中，測定量筒和蛋白粉總質(zhì)量(記為m2)，則堆積密度按式(2)計(jì)算。

(2)

溶解度測定參照GB5413.29—2010《嬰幼兒食品和乳品溶解性的測定》。

1.2.7 蛋白粉白度、濕潤性、分散性及流動性的測定

蛋白粉白度測定采用色差儀[10]；濕潤性、分散性及流動性測定參照王一等[11]的方法。

1.2.8 南極磷蝦蛋白粉營養(yǎng)成分分析

南極磷蝦蛋白粉蛋白質(zhì)、脂肪等基本營養(yǎng)成分測定等參照李明杰的方法[12]。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0 軟件中線性回歸(linear regression)、單因素方差分析(one-way ANOVA)、多因素方差分析(univariate)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦蛋白酶解工藝

圖1～圖5分別是加酶量、酶解溫度、pH值、酶解時(shí)間和料液比對水解度的影響。由圖1可知，酶用量越高，水解度越高，當(dāng)酶用量為1 800～3 000 U/g蛋白時(shí)，水解度上升顯著。當(dāng)酶用量繼續(xù)增加，水解度增加緩慢，差異不顯著。當(dāng)酶用量為3 000～4 200 U/g時(shí)，水解度增幅逐漸減小，趨于平衡。故酶用量確定為3 000 U/g。酶解溫度對水解度的影響見圖2， 為明顯的峰狀曲線。當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)水解度最高，且與其他溫度條件存在顯著性差異，表明55 ℃為最適酶解溫度。pH對蛋白回收率的影響同溫度相似，同樣呈較為典型的峰狀曲線，當(dāng)pH 6.5時(shí)水解度最高，且與其他pH值存在顯著差異，所以pH對酶解反應(yīng)影響很大[13]。

圖1 加酶量對水解度的影響Fig.1 Influence of enzyme content on hydrolysis degree

由圖4可知，酶解時(shí)間越長，水解度越高，而酶解時(shí)間達(dá)2 h后，水解度差異不顯著。圖5表明隨著料液比增加，水解度呈逐漸下降趨勢。雖然當(dāng)料液比為1∶1時(shí)，水解過程中會出現(xiàn)酶解不充分的現(xiàn)象。而當(dāng)料液比為1∶2時(shí)，下降不多，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此時(shí)酶解反應(yīng)比較充分。因此選擇料液比1∶2 作為酶解反應(yīng)的濃度。實(shí)踐表明，食品蛋白的酶解改性具有安全可靠、作用溫和、專一性強(qiáng)、效率較高的特點(diǎn)[14-16]。

圖2 溫度對水解度的影響Fig.2 Influence of temperature on hydrolysis degree

圖3 pH對水解度的影響Fig.3 Influence of pH on hydrolysis degree

圖4 酶解時(shí)間對水解度的影響Fig.4 Influence of time on hydrolysis degree

圖5 料液比對水解度的影響Fig.5 Influence of the material solution to hydrolysis degree

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：酶用量3 000 U/g蛋白、酶解溫度55 ℃、pH 6.5、酶解時(shí)間2 h和料液比1∶2為最佳酶解條件。

2.2 南極磷蝦酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量排布

按照木瓜蛋白酶用量3 000 U/g蛋白、55 ℃、pH 6.5、酶解時(shí)間2 h、料液比1∶2的工藝條件酶解南極磷蝦，所得酶解液的相對分子質(zhì)量見圖6。首先，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量及其對應(yīng)的出峰時(shí)間，求出相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用南極磷蝦酶解物上柱，記錄出峰時(shí)間，從標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出南極磷蝦酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量。由圖6可以看出南極磷蝦酶解液的分子質(zhì)量多集中在3～10 kDa。通過前述實(shí)驗(yàn)條件制備的南極磷蝦酶解產(chǎn)物中相對分子質(zhì)量大多處于3～10 kDa，表明該水解條件較為理想。

圖6 南極磷蝦酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量排布Fig.6 Molecular weight distribution of Euphausia superba enzymolysis products

2.3 噴霧干燥工藝對南極磷蝦蛋白粉品質(zhì)的影響

2.3.1 進(jìn)料濃度對蛋白粉品質(zhì)的影響

表1列出不同進(jìn)料量對南極磷蝦蛋白粉的影響。進(jìn)料濃度很大程度上影響噴霧干燥的效果，還影響著噴霧干燥生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)成本。由表1可以看出，物料的進(jìn)料濃度越大，蛋白粉水分含量越低。而蛋白粉的白度隨著進(jìn)料濃度的加大而有所降低，白度的測定采用申光WSC-S測色色差計(jì)測量，這是因?yàn)楫?dāng)濃度達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，液滴表面水分蒸發(fā)速度快，表層容易形成固殼，使得粉粒內(nèi)部殘留部分水分，造成白度有所降低[17]。

當(dāng)進(jìn)料液蛋白質(zhì)量濃度較高(200 g/L，250 g/L)時(shí)，蛋白粉的堆積密度比進(jìn)料液蛋白質(zhì)量濃度較低(100 g/L，150 g/L)時(shí)要高。這可能是由于進(jìn)料濃度增大導(dǎo)致了料液在經(jīng)霧化后的產(chǎn)品水分含量降低，更為干燥，因此堆積密度增大。而流動性和分散性則隨著進(jìn)料濃度的升高有所降低?？傮w而言，進(jìn)料濃度對白度、堆積密度等品質(zhì)指標(biāo)影響并不顯著。因此，應(yīng)從干燥后水分含量低的高濃度進(jìn)料濃度考慮。但當(dāng)用大于250 g/L的進(jìn)料濃度進(jìn)行噴霧干燥時(shí)，料液變得過于黏稠。盡管采用磁力攪拌器攪拌，但霧化效果極差，霧化噴頭處極易出現(xiàn)油狀黏稠液滴。雖然所得蛋白粉水分含量及分散性的指標(biāo)好，但從實(shí)際出發(fā)，選擇進(jìn)料液蛋白濃度25%較為適宜。

表1 不同進(jìn)料液蛋白質(zhì)量濃度對南極磷蝦蛋白粉品質(zhì)的影響Table 1 Effect of liquid concentration on protein powder quality

注：進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃，進(jìn)料溫度30 ℃，進(jìn)料速度12 mL/min；同列不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.3.2 進(jìn)風(fēng)溫度對蛋白質(zhì)品質(zhì)的影響

表2給出了進(jìn)風(fēng)溫度對南極磷蝦蛋白粉品質(zhì)影響。由表2可以看出，干燥后的蛋白粉水分含量和進(jìn)風(fēng)溫度成反比。堆積密度測定方法為：用漏斗向量筒中均勻地撒落樣品，撒滿后稱量樣品的質(zhì)量,計(jì)算堆積密度[18]。當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度較低(160 ℃，170 ℃)，蛋白粉的白度，堆積密度，流動性和濕潤性等無明顯差異。此時(shí)由于含水量較高，噴霧干燥所得蛋白粉黏度較高，因此無法測量分散性?？傮w而言，進(jìn)風(fēng)溫度越高，蛋白粉品質(zhì)有所升高，但當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度超過190 ℃后，部分蛋白粉發(fā)生了高溫變性，導(dǎo)致蛋白粉附著于噴霧干燥管壁，以至于得率降低。最終確定噴霧干燥進(jìn)風(fēng)溫度為180 ℃。

表2 進(jìn)溫度對南極磷蝦蛋白粉品質(zhì)的影響Table 2 Effect of feeding temperature on protein powder quality

注：進(jìn)料溫度30 ℃、進(jìn)料速度12 mL/min，進(jìn)料液蛋白質(zhì)量濃度25%，“-”表示未能檢測，下同。同列不同字母表示在P=0.05水平上差異顯著。

2.3.3 進(jìn)料速度對蛋白質(zhì)品質(zhì)的影響

表3列出進(jìn)料速度對南極磷蝦蛋白粉品質(zhì)的影響。從表可以看出，蛋白粉的水分和白度隨著進(jìn)料速度的增加而上升。這是由于物料經(jīng)噴霧系統(tǒng)處理后變?yōu)樾∫旱危M(jìn)料量越大，在造霧壓力一定的情況下，料液被霧化成霧滴的粒徑越大，由于慣性作用其速度也越大，其在干燥器內(nèi)停留時(shí)間短，容易發(fā)生干燥不完全的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致終產(chǎn)品含水率較高[19]。而進(jìn)料速度和蛋白粉堆積密度成反比。

表3 進(jìn)料速度對南極磷蝦蛋白粉品質(zhì)的影響Table 3 Effect of feeding speed on protein powder quality

注：進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃，進(jìn)料濃度250 g/L，進(jìn)料溫度30 ℃。同列不同字母表示在P=0.05水平上差異顯著。

這可能由于進(jìn)料速度加大后，霧化的小液滴量增加，在熱空氣量恒定的條件下，單位質(zhì)量小液滴吸收熱量降低，導(dǎo)致干燥顆粒含水量增加，相互黏結(jié)趨勢增大，產(chǎn)生較大的堆積體積，堆積密度降低[20]。當(dāng)進(jìn)料速度為6 mL/min和8 mL/min時(shí)，流動性和分散性間差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)進(jìn)料速度增大，流動性變化較大，然而進(jìn)料速度大于12 mL/min后，水分含量過高，蛋白粉分散性變差。此外，不同進(jìn)料速度組蛋白粉白度無顯著性差異。綜合考慮后確定進(jìn)料速度保持在12 mL/min較為適宜。

2.3.4 進(jìn)料溫度對蛋白粉品質(zhì)的影響

表4為進(jìn)料溫度對南極磷蝦蛋白粉的影響。由表4可知，隨著進(jìn)料溫度的升高，水分含量下降，堆積密度上升，而分散性、流動性變好，進(jìn)料溫度對白度影響不明顯。這可能是因?yàn)檫M(jìn)料溫度升高后加快噴霧液滴的干燥，提高干燥效率，干燥更為徹底。由表4可知，進(jìn)料溫度30 ℃和60 ℃的物料干燥后所得產(chǎn)物水分含量均低于5%，達(dá)到GB 11674—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)乳清粉和乳清蛋白粉》要求。從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，選擇30 ℃更為方便，確定30 ℃為進(jìn)料溫度。

按各單因素試驗(yàn)確定的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行組合試驗(yàn)后，得到的蛋白粉品質(zhì)如表5所示。蛋白粉外觀呈白色粉狀，顆粒較細(xì)，吸濕性較強(qiáng)。

表4 進(jìn)料溫度對南極磷蝦蛋白粉品質(zhì)的影響Table 4 Effect of feeding temperature on protein powder quality

注：進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃，進(jìn)料液蛋白質(zhì)量濃度250 g/L，進(jìn)料速度12 mL/min。同列不同字母表示在P= 0.05水平上差異顯著。

表5 南極磷蝦蛋白粉噴霧干燥組合試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Combination test results of Antarctic krill protein powder spray drying

2.4 南極磷蝦蛋白粉品質(zhì)分析

按照工藝參數(shù)：進(jìn)料液蛋白質(zhì)量濃度250 g/L、進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃、進(jìn)料速度12 mL/min制備的南極磷蝦蛋白粉基本營養(yǎng)成分等指標(biāo)見表6。南極磷蝦蛋白粉中脂肪含量顯著降低，僅為8.3 mg/L，且含有Fe、Na等礦物元素。

表7是南極磷蝦蛋白粉氨基酸成分和河蚌蛋白粉比較。由表7可以看出，南極磷蝦蛋白粉中氨基酸總含量要明顯高于河蚌蛋白粉。其中，河蚌蛋白粉中呈鮮、呈甜的氨基酸(天門冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和丙氨酸)占總氨基酸的 22.7%[21]。

表6 南極磷蝦蛋白粉主要成分Table 6 The main components of Antarctic krill protein powder

南極磷蝦蛋白粉中呈鮮、甜味的氨基酸占氨基酸總量的45.4%，南極磷蝦蛋白粉中谷氨酸占總氨基酸含量比例最高，為14.57%。此外，南極磷蝦蛋白粉中必需氨基酸占總氨基酸的38.85%，這項(xiàng)結(jié)果表明南極磷蝦蛋白粉是生產(chǎn)海鮮調(diào)味品的優(yōu)質(zhì)原料，且在人類保健方面具有極高的開發(fā)利用前景。

表7 南極磷蝦蛋白粉氨基酸組成分析 單位：g/100g

3 結(jié)論

(1)采用木瓜蛋白酶對南極磷蝦進(jìn)行酶解制備南極磷蝦蛋白粉，最佳酶解參數(shù)：每100 g南極磷蝦肉糜中木瓜蛋白酶用量3 000 U/g蛋白、酶解溫度55 ℃、 酶解pH 6.5、酶解時(shí)間2 h、料液比1∶2。按上述工藝制備的南極磷蝦酶解液水解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量多為3 000～5 000 Da。

(2)南極磷蝦酶解液噴霧干燥最佳工藝參數(shù)：進(jìn)料液蛋白質(zhì)量濃度250 g/L、進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃、進(jìn)料溫度30 ℃、 進(jìn)料速度12 mL/min。由該工藝參數(shù)制備的南極磷蝦蛋白粉各特性指標(biāo)較好，呈白色粉狀吸濕性較強(qiáng)。

(3)按最佳工藝制備的南極磷蝦蛋白粉是具蝦香味的干燥粉末，其主要成分為：氨基態(tài)氮 2.87%，多糖 4.7%，脂肪 0.83%，灰分為 23.19%。