李玲，郭燕云，周怡

(臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂，276000)

肌原纖維蛋白是肉類中含量最高最重要的蛋白質(zhì)，占總蛋白的55%～60%，其主要功能特性是能夠形成熱誘導(dǎo)凝膠，從而賦予肉類制品良好的質(zhì)地和口感。肉類產(chǎn)品在加工過程中很容易發(fā)生蛋白質(zhì)氧化從而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降，營養(yǎng)價值降低，甚至影響消費者的健康安全[1]。蛋白質(zhì)氧化會導(dǎo)致蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)修飾，蛋白質(zhì)大分子發(fā)生交聯(lián)聚集等，從而影響肉制品的色澤、保水性和口感[2]。近年來關(guān)于肌原纖維蛋白氧化凝膠特性的研究多集中在氧化劑種類、濃度、離子強(qiáng)度(食鹽、磷酸鹽含量)及不同的抗氧化劑等方面[3-6]。關(guān)于氧化的肌原纖維蛋白對熱誘導(dǎo)凝膠特性的研究機(jī)制還有待繼續(xù)探討[7-9]，凝膠水分分布與蛋白質(zhì)氧化程度之間的關(guān)系需要深入研究。本試驗采用羥自由基模擬氧化體系對肌原纖維蛋白進(jìn)行不同程度的氧化處理，研究氧化程度對蛋白活性巰基、疏水性、二聚酪氨酸以及內(nèi)源色氨酸熒光強(qiáng)度等蛋白質(zhì)理化特性的影響，采用低場核磁技術(shù)研究蛋白質(zhì)氧化與凝膠水分分布之間的關(guān)系，為凝膠類肉制品的加工提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

豬背最長肌(小里脊)購自南京蘇果超市，本研究主要在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品工程中心完成。KCl、MgCl2、EGTA、Na2HPO4、NaCl、NaOH、CuSO4、酒石酸鉀鈉、FeCl3、抗壞血酸、H2O2、甘氨酸、EDTA、DTNB(5,5’-二硫雙(5’-硝基苯甲酸))、Trolox(水溶性維生素E)，以上試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。牛血清蛋白，購于沃卡威(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

PQ001核磁共振分析儀，上海紐邁電子設(shè)備有限公司；RetschGM200絞肉機(jī)，IKA T25勻漿機(jī)，Avanti J-26S XP高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman coulter；CR-400色差儀(日本柯尼卡美能達(dá)公司)，M2e多功能酶標(biāo)儀(美國MD公司)，UV-2800A型紫外可見分光光度計。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參考PARK等[10]和FENG等[5]的方法并略作修改。在市場上購買最新鮮的豬背肌(小里脊)，用刀剔除豬肉上多余的筋膜、脂肪后，將豬肉切成均勻的小塊并用絞肉機(jī)攪碎，所得的肉糜用于接下來提取豬肉肌原纖維蛋白。稱取50 g肉樣，加4倍體積的pH 7.0緩沖液(0.1 mol/L KCl, 2 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Na2HPO4)勻漿離心，棄上清液，取沉淀重復(fù)上述步驟3遍。所得沉淀加入4倍體積的0.1 mol/L NaCl洗液，勻漿離心，沉淀重復(fù)洗滌2次，第3次加洗液勻漿后，用4層紗布過濾以除去結(jié)締組織等，最后用0.1 mol/L HCl調(diào)pH值為6.25后離心除去上清液，所得膏狀物為肌原纖維蛋白。

1.3.2 羥自由基氧化體系的構(gòu)建及氧化

參考XIONG等[11]的方法并修改。首先用20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)將豬肉肌原纖維蛋白溶解后，在溶解后的蛋白質(zhì)溶液中依次加入無水FeCl3、抗壞血酸、H2O2溶液以用來構(gòu)建羥自由基的模擬氧化體系，并且整個體系最終含有以下成分：20 mg/mL的豬肌原纖維蛋白、0.01 mmol/L的FeCl3和0.1 mmol/L的VC，其中的H2O2分為0、0.5、1、5、10 mmol/L 5個濃度梯度。在4 ℃恒溫操作間中氧化12個小時后，用1 mmol/L Trolox/EDTA來終止氧化反應(yīng)，此即為氧化后的豬肉肌原纖維蛋白，貯藏于0～4 ℃，2 d內(nèi)用完。

1.4 物理化學(xué)性能的測定

自由巰基和總巰基含量按照XIA等[12]的方法進(jìn)行測定。疏水性測定采用溴酚藍(lán)結(jié)合法進(jìn)行，參照CAO[4]描述的方法進(jìn)行測定。二聚酪氨酸含量參考李學(xué)鵬等[13]的方法測定。內(nèi)源色氨酸熒光的變化通過F4600熒光分光光度儀進(jìn)行檢測。用 20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)將樣品稀釋為0.1 mg/mL。激發(fā)波長283 nm，記錄下300～400 nm的發(fā)射光譜。

1.5 熱誘導(dǎo)蛋白凝膠的制備及性能測定

將氧化后的豬肉肌原纖維蛋白調(diào)至40 mg/mL后，在80 ℃下水浴30 min，制得凝膠，用于測定其蒸煮得率、白度、保水性及凝膠水分分布分析。

1.5.1 蒸煮得率計算

將凝膠倒置于濾紙上，用濾紙吸干水分，稱量凝膠重量。蒸煮得率以蒸煮后的質(zhì)量與蒸煮前的質(zhì)量的比值計算。

1.5.2 凝膠白度測定

用色差儀測定蛋白凝膠的色差值，其中亮度值L*；紅度值a*；黃度值b*。儀器經(jīng)零點白板校正后進(jìn)行樣品測定，每組測定3次，取平均值。凝膠白度值按式(1)計算。

(1)

1.5.3 凝膠保水性測定

用離心法測定凝膠保水性(water holding capacity，WHC)，將制備好的蛋白凝膠準(zhǔn)確稱其質(zhì)量后，于 4 ℃下 6 000×g離心15 min，記錄離心前后離心管的質(zhì)量以及空管質(zhì)量。WHC按式(2)計算。

(2)

式中：m2為離心出液體后離心管與凝膠的質(zhì)量，g；m1為離心前離心管與凝膠的質(zhì)量，g；m為空管質(zhì)量，g。

1.5.4 凝膠水分分布的測定

低場核磁數(shù)據(jù)測量參考HAN等[6]和JI等[14]的方法進(jìn)行。測定條件：質(zhì)子共振頻率為22.6 MHz，測量溫度為32 ℃。將大約1.0 g樣品放入直徑15 mm核磁管中，隨后立即放入PQ001核磁共振成像儀中進(jìn)行分析。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列測定樣品弛豫時間T2值。不同弛豫時間各峰峰面積分別記為P21，P22和P23。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗重復(fù)進(jìn)行3次，每次重新提取肌原纖維蛋白。用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s多重比較和差異顯著性分析(P<0.05)。所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白中游離巰基含量的影響

氧化程度對肌原纖維蛋白游離巰基含量的影響見圖1。游離巰基的含量隨H2O2濃度的升高而降低，對照組與其余各組之間差異顯著(P<0.05)。當(dāng)H2O2濃度1 mmol/L時，游離巰基含量比對照組降低了9.6%，H2O2濃度為10 mmol/L時下降最明顯，下降了19.4%。這與前人的研究基本一致[15-16]，氧化導(dǎo)致肌原纖維蛋白的游離巰基轉(zhuǎn)變?yōu)槎蜴I及相關(guān)化合物，氧化同時引起蛋白質(zhì)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生修飾，導(dǎo)致游離巰基含量減少。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)添加抗氧化劑也未能阻止氧化引起的巰基減少[17]，其原因可能是蛋白質(zhì)側(cè)鏈中巰基是最容易受到氧化攻擊的基團(tuán)。

圖1 不同氧化程度對肌原纖維蛋白游離巰基含量的影響Fig.1 Effect of different oxidation degrees on the freesulfydryl of myofibrillar protein注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

氧化程度對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響見圖2。隨著H2O2濃度的升高，蛋白質(zhì)表面疏水性逐漸增大。H2O2濃度0 mmol/L與0.5 mmol/L組差異不顯著(P<0.05)，這可以說明在較低的濃度進(jìn)行氧化處理時，蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化很小。繼續(xù)增大H2O2濃度，溴酚藍(lán)(BPB)結(jié)合量顯著增大，H2O2濃度為1 mmol/L 與5 mmol/L組差異顯著(P<0.05)。H2O2濃度5 mmol/L與10 mmol/L 組差異顯著(P<0.05)。其中，5 mmol/L組H2O2濃度比對照組增加了75.3%；而10 mmol/L組比對照組增加了103.6%。蛋白質(zhì)氧化后，經(jīng)過變性解折疊，就會很容易增強(qiáng)其表面疏水性，從而分子之間就會發(fā)生交聯(lián)和聚集等反應(yīng)[11]。本研究中隨氧化劑濃度的升高，蛋白質(zhì)表面疏水性增加，這說明蛋白質(zhì)的構(gòu)象在氧化劑處理下會發(fā)生比較顯著的變化，蛋白質(zhì)分子的表面會暴露出更多的疏水氨基酸殘基，并且逐漸被氧化，此外，蛋白質(zhì)的疏水性還與其他的許多因素有關(guān)，比如氨基酸之間會發(fā)生疏水相互作用以及氧化會導(dǎo)致的蛋白質(zhì)間發(fā)生聚集和交聯(lián)等反應(yīng)[18]。所以，蛋白質(zhì)的側(cè)鏈發(fā)生氧化、去折疊和聚集等變化，從而三者之間的相互影響導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水性等性質(zhì)發(fā)生改變。

圖2 不同氧化程度對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of different oxidation degrees on the BPB content of myofibrillar protein

2.3 氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響

肌原纖維蛋白酪氨酸殘基被氧化后就會形成二聚酪氨酸，并且會通過共價鍵和非共價鍵之間的相互作用形成蛋白質(zhì)的聚集物，能夠反映蛋白質(zhì)氧化的程度和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。豬肉肌原纖維蛋白經(jīng)羥自由基氧化處理之后，二聚酪氨酸的含量變化如圖3所示，隨著氧化劑濃度的增加，二聚酪氨酸相對熒光值增大，0.5、5和10 mmol/L組與對照組差異顯著(P<0.05)。與對照組相比，5 mmol/L和10 mmol/L組分別增加了50%和57%，說明酪氨酸殘基對于·OH也比較敏感，易發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步聚合而形成二聚酪氨酸。有研究采用2種自由基氧化大黃魚肌原纖維蛋白時均發(fā)現(xiàn)，隨氧化劑濃度的升高，二聚酪氨酸含量顯著增加，并且與對照組相比差異顯著[13]。而XIONG等[19]研究發(fā)現(xiàn)在3種氧化體系中，肌原纖維蛋白的二聚酪氨酸含量與對照組沒有顯著差異，其測定的酪氨酸含量與其他食品中含量一致，認(rèn)為二聚酪氨酸不是蛋白質(zhì)氧化交聯(lián)的主要方式。出現(xiàn)不同的研究結(jié)果，可能與氧化劑的濃度以及氧化體系的差異引起的，將來有可能探討二聚酪氨酸新的測定方法，解決爭議問題。

圖3 不同氧化程度對肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響Fig.3 Effect of different oxidation degrees on the dityrosine of myofibrillar protein

2.4 氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光強(qiáng)度的影響

肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光強(qiáng)度見圖4，隨著H2O2濃度的逐漸升高，蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度顯著降低。內(nèi)源熒光是用來表示蛋白質(zhì)氧化程度和微環(huán)境的影響，進(jìn)而揭示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化情況。

圖4 不同氧化程度對肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光的影響Fig.4 Effect of different oxidation degrees on the tryptophan fluoescence of myofibrillar protein

對于蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降的原因，我們認(rèn)為一種可能是在蛋白質(zhì)的氧化初期，由于色氨酸殘基發(fā)生了包埋而引起的，并且隨著時間的延長包埋的效率會逐漸越來越低，由此可知蛋白質(zhì)的包埋程度會受到氧化劑濃度的影響，并且所受影響較大；另一種可能是氧化處理會使得蛋白質(zhì)側(cè)鏈中的熒光氨基酸被猝滅等[20]。

2.5 氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白凝膠蒸煮得率、白度、保水性的影響

氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白凝膠性能的影響見表1。蛋白質(zhì)凝膠的蒸煮得率隨H2O2濃度的增加，凝膠蒸煮得率降低，各組之間顯著差異(P<0.05)。5 mmol/L H2O2組與對照組相比，凝膠蒸煮得率下降了24.16%，10 mmol/L組與對照組相比，凝膠蒸煮得率下降了22.4%，這可能是由于在較高濃度的氧化處理之下，就會破壞豬肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，部分水分析出，形成汁液流失，從而導(dǎo)致凝膠的蒸煮得率顯著降低[3]。

如表1所示，隨H2O2濃度的增加，白度值逐漸下降，10 mmol/L組與對照組顯著差異(P<0.05)，其余各組與對照組差異不顯著(P>0.05)。蛋白凝膠的白度可以體現(xiàn)蛋白質(zhì)的變性程度，根據(jù)XIA等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白凝膠白度值的下降，與氧化產(chǎn)物和蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈之間發(fā)生非酶褐變等的反應(yīng)相關(guān)。本研究中，高濃度的H2O2，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化嚴(yán)重。

表1 氧化程度對肌原纖維蛋白凝膠蒸煮得率、白度及保水性的影響Table 1 Effect of different oxidation degrees on the boiling rate, whiteness and water holding capacity of myofibrillar protein

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

蛋白凝膠的保水性隨H2O2濃度的增加而降低，10 mmol/L組與其余各組差異顯著(P<0.05)。與對照組相比，當(dāng)H2O2濃度增加到 10 mmol/L時，蛋白質(zhì)凝膠保水性下降了16.47%(P<0.05)。蛋白質(zhì)凝膠的保水性主要是由于蛋白質(zhì)的水合作用和毛細(xì)管作用力，從而水分就會被束縛在蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中。肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠有以下作用力：疏水作用力、氫鍵、靜電作用力、巰基氧化形成的二硫鍵等，需要經(jīng)歷變性、聚集和交聯(lián)3個過程，任何影響這3個過程的因素都會影響蛋白質(zhì)的熱誘導(dǎo)凝膠特性[10]。高濃度氧化劑導(dǎo)致肌原纖維蛋白交聯(lián)形成部分二硫鍵，蛋白質(zhì)分子表面也會暴露出更多的疏水氨基酸殘基，疏水性氨基酸通過疏水相互作用形成不溶性聚集物，溶解度下降，使肌原纖維蛋白凝膠結(jié)構(gòu)變得疏松，在凝膠結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生較多的空隙，水分流失，使得蛋白質(zhì)的水合作用和毛細(xì)管作用力逐漸降低，并且蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)中的空隙逐漸增多，讓蛋白質(zhì)凝膠中一部分不易流動的水變成了自由水，所以凝膠保水性也變差[3]。

2.6 氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白凝膠水分分布的影響

氧化程度對肌原纖維蛋白水分分布圖譜見圖5。

圖5 不同氧化程度對肌原纖維蛋白凝膠水分子的T2弛豫特性的影響Fig.5 Effect of different oxidation degrees on T2 relaxation time of myofibrillar protein

豬肉肌原纖維蛋白凝膠弛豫時間(T2)在1～10 000 ms 內(nèi)出現(xiàn)了3個峰，這與韓敏義等[6]研究豬肉肌原纖維蛋白熱凝膠的試驗結(jié)果基本一致。T2值范圍內(nèi)對應(yīng)的3個峰分別對應(yīng)凝膠中的3種狀態(tài)的水，弛豫時間T21在0～15 ms，屬于凝膠中的結(jié)合水，弛豫時間T22在63～382 ms，屬于凝膠中的不易流動水，弛豫時間T23在714～2 171 ms，屬于凝膠中的自由水。弛豫時間(T2)在1～10 000 ms對應(yīng)的3個峰的峰面積分別記為P21,P22,P23。通過分析各峰的峰面積結(jié)果可以得知(如表2)，H2O2濃度對結(jié)合水含量P21影響不大(P>0.05)。結(jié)合水是肌原纖維蛋白凝膠中與蛋白質(zhì)大分子結(jié)合的水分子，大部分研究結(jié)果表明，T21與肉的微觀結(jié)構(gòu)及機(jī)械壓力無關(guān)[22-23]。不易流動的水P22隨H2O2濃度的增加而下降，其中H2O2濃度為5 mmol/L和10 mmol/L時與對照組差異顯著(P<0.05)，H2O2濃度為0.5 mmol/L和1 mmol/L 時與對照組差異不顯著(P>0.05)。自由水含量P23隨H2O2濃度的增加而增加，其中H2O2濃度為0.5 mmol/L 和1 mmol/L 時與對照組差異不顯著(P>0.05)， H2O2濃度為5 mmol/L和及10 mmol/L時與對照組差異顯著(P<0.05)，P23分別增加了54%和73%。上述分析表明，隨著H2O2濃度的升高，豬肉肌原纖維蛋白凝膠中的一部分不容易流動的水可能會變成自由水，但自由水是蛋白凝膠結(jié)構(gòu)中結(jié)合最不緊密的水和最容易損失的水[24]。其他研究也發(fā)現(xiàn)，豬肉保水性與T2弛豫時間存在很強(qiáng)的相關(guān)性[25-26]。因此，H2O2濃度越大，不易流動的水含量越低，而自由水含量就越高，凝膠保水性越低，這與本試驗關(guān)于豬肉肌原纖維蛋白的凝膠保水性研究結(jié)果相一致。

表2 羥自由基氧化對豬肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠峰面積的影響Table 2 Effect of different oxidation degrees on thepeaks area proportion of myofibrillar protein

2.7 相關(guān)性分析

由相關(guān)性分析表明(見表3)，H2O2濃度與豬肌原纖維蛋白中游離巰基含量極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.931，P<0.01)，與疏水性值(r=0.963，P<0.01)和二聚酪氨酸含量(r=0.787，P<0.01)正相關(guān)，說明H2O2濃度越高，蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)越容易被氧化修飾，從而影響蛋白質(zhì)的功能特性。H2O2濃度與凝膠蒸煮得率(r=-0.554，P<0.05)顯著負(fù)相關(guān)，及凝膠保水性(r=-0.904，P<0.01)極顯著負(fù)相關(guān)，說明H2O2濃度越高，凝膠的蒸煮得率、保水性越差。同時游離巰基含量與凝膠蒸煮得率顯著相關(guān)(r=0.597，P<0.05)，與凝膠保水性(r=0.888，P<0.01) 極顯著相關(guān)；疏水性與凝膠蒸煮得率極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.702，P<0.01)，與凝膠保水性(r=-0.790，P<0.01)極顯著負(fù)相關(guān)。這表明H2O2濃度越高，蛋白被氧化程度越嚴(yán)重，凝膠的蒸煮得率、保水性越差。

表3 各指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between indexes of gels

注：*表示P<0.05 水平差異顯著；**表示P<0.01 水平差異極顯著。

3 結(jié)論

在羥自由基氧化體系中，隨著氧化劑濃度的增加，豬肉肌原纖維蛋白游離巰基含量、內(nèi)源色氨酸熒光強(qiáng)度、蛋白質(zhì)凝膠的蒸煮得率、白度和保水性以及低場核磁中不易流動水含量顯著下降，而二聚酪氨酸含量、表面疏水性和低場核磁中自由水含量增加。以上變化可以說明氧化處理使肌原纖維蛋白側(cè)鏈基團(tuán)中的游離巰基、酪氨酸、色氨酸殘基發(fā)生顯著的氧化修飾，蛋白質(zhì)分子之間彼此發(fā)生交聯(lián)和聚集等反應(yīng)，蛋白質(zhì)構(gòu)象進(jìn)一步發(fā)生顯著變化，進(jìn)而影響其凝膠的保水性。