洛雪，時旭，史海粟，杜阿楠，陳茜，烏日娜，武俊瑞

(沈陽農(nóng)業(yè)大學 食品學院，遼寧 沈陽，110866)

乳酸菌屬于革蘭氏陽性菌，微好氧，能夠發(fā)酵碳水化合物生產(chǎn)乳酸，通常乳酸菌基因組中G+C含量較低，它與人類有密切的關(guān)系，是人類正常腸道菌群的組成成分，如雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、羅氏菌屬(Rothia)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和明串珠菌屬(Leuconoostoc)等[1-2]。其中部分乳酸菌及其發(fā)酵產(chǎn)物有一定的生理功能，能夠調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、調(diào)節(jié)免疫功能、降低膽固醇、抑制有害菌生長等。并且它還能賦予發(fā)酵食品特有的滋氣味和質(zhì)感[3-4]，因此近年來乳酸菌成為研究的熱點，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，諸多的乳酸菌全基因組(S.thermophilus、Lactococcuslactis、Lactobacillusacidophilus、Lactobacillusplantarun等[5-6])逐步測序成功，成為模式生物，基因工程改造的乳酸菌逐漸應用于食品工業(yè)、醫(yī)藥、保健品和飼料等行業(yè)[7]。前期乳酸菌的研究主要集中在菌群結(jié)構(gòu)及多樣性分析[8-9]、益生菌資源的挖掘[10-11]、優(yōu)化乳酸菌及其產(chǎn)物的發(fā)酵條件等[12-13]。20世紀后期，研究人員開始研究乳酸菌基因功能、生物學特性及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的分子機制。研究人員開始將外源基因轉(zhuǎn)入乳酸菌中，提升乳酸菌的益生性能[14]，但由于乳酸菌細胞壁緊致、厚密，外源DNA很難進入受體細胞，故而轉(zhuǎn)化效率極低[15-16]，嚴重制約了乳酸菌分子生物學的研究和基因工程技術(shù)的發(fā)展[17-18]。目前應用最廣泛的乳酸菌轉(zhuǎn)化外源DNA的方法是電轉(zhuǎn)化法(electrotransformation)[19-20]，該方法將乳酸菌放入到外加電場中，電流作用細胞壁和細胞膜表面產(chǎn)生微小通道，由于電導率和通透性發(fā)生變化，外源DNA可以進入細胞內(nèi)[21]，當電場消失后，乳酸菌經(jīng)過富集培養(yǎng)，微小通道會消失，不會對細菌產(chǎn)生很大影響[22-23]。本研究選擇乳酸菌組成型質(zhì)粒pMG36e作為載體，該質(zhì)粒已是一款成熟的表達載體[24]，研究甘氨酸濃度、菌體生物量、電極緩沖液、電壓和質(zhì)粒濃度對嗜熱鏈球菌轉(zhuǎn)化效率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜熱鏈球菌sp1.1：本實驗室前期同學分離自內(nèi)蒙地區(qū)發(fā)酵乳制品，后經(jīng)鑒定為嗜熱鏈球菌。

pMG36e質(zhì)粒：本實驗室保藏。

甘油、甘氨酸、紅霉素、蔗糖、檸檬酸銨、MgCl2、KH2PO4、K2HPO4等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

Gene Pilser Xcell電轉(zhuǎn)儀，美國BIO-RAD公司；MILLI-Q超純水儀，美國Millipore公司；BS124S萬分之一分析天平，北京賽多利斯公司；PB-10精密酸度計，北京賽多利斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅霉素殺傷曲線

將凍干或甘油冷凍保存的S.thermophilussp1.1純化三代，進行純培養(yǎng)，挑取單菌落接種于M17液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。制備不同濃度的紅霉素平板(紅霉素質(zhì)量濃度5～30 μg/mL)。

1.3.2 甘氨酸對S.thermophilus感受態(tài)細胞的影響

按1%的接種量將S.thermophilussp1.1接入含有不同濃度甘氨酸的培養(yǎng)基(甘氨酸質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50 g/L)中進行培養(yǎng)，測定其12 h的生長曲線，以甘氨酸0 g/L的為對照。

1.3.3 菌體生物量對電轉(zhuǎn)化率的影響

按1%接種量將S.thermophilussp1.1接入含有10 g/L甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，收集OD600為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0的菌體，制備S.thermophilus感受態(tài)細胞。

混合質(zhì)粒與感受態(tài)細胞，冰浴，用電穿孔儀進行電擊，電擊結(jié)束后37 ℃溫育復蘇培養(yǎng)，將復蘇后菌液涂布在紅霉素抗性平板上，37 ℃靜置培養(yǎng)48～72 h，比較不同菌體生物量對電轉(zhuǎn)化率的影響。陰性對照為不加質(zhì)粒的感受態(tài)細胞。

1.3.4 電極緩沖液對電轉(zhuǎn)化率的影響

按1%接種量將S.thermophilussp1.1接入含有10 g/L甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，收集OD600為0.8的菌體，比較不同電轉(zhuǎn)緩沖液 Ⅰ(0.5 mol/L蔗糖，1.0 mol/L MgCl2，1.0 mmol/L KH2PO4/K2HPO4；pH 7.4)、Ⅱ(0.5 mol/L蔗糖，1 mmol/L檸檬酸銨；pH 6.0)、Ⅲ(272 mmol/L蔗糖，150 g/L甘油)、Ⅳ(272 mmol/L蔗糖，100 g/L甘油，10 mmol/L磷酸鹽緩沖液；pH 7.4)和100 g/L甘油電轉(zhuǎn)緩沖液對電轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果，感受態(tài)細胞具體制作方法同1.3.3。 陰性對照為不加質(zhì)粒的感受態(tài)細胞。

1.3.5 電壓對電轉(zhuǎn)化率的影響

按1%接種量將S.thermophilussp1.1接入含有10 g/L甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，收集OD600為0.8的菌體，利用電轉(zhuǎn)緩沖液Ⅱ制備感受態(tài)細胞，具體制作方法同1.3.3。設(shè)置電壓為1.4、1.6、 1.8、2.0、2.2和2.4 kV進行電轉(zhuǎn)化。37 ℃靜置培養(yǎng)48～72 h后，比較不同電壓對電轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果。陰性對照為不加質(zhì)粒的感受態(tài)細胞。

1.3.6 質(zhì)粒濃度對電轉(zhuǎn)化率的影響

按1%接種量將S.thermophilussp1.1接入含有10 g/L甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，收集OD600為0.8的菌體，利用電轉(zhuǎn)緩沖液Ⅱ制備感受態(tài)細胞，制備電壓選取1.8 kV，具體制作方法同1.3.3。設(shè)計質(zhì)粒質(zhì)量濃度設(shè)為0.2～1.6 g/L進行電轉(zhuǎn)化。37 ℃ 靜置培養(yǎng)48～72 h后，比較不同電壓對電轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果。陰性對照為不加質(zhì)粒的感受態(tài)細胞。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅霉素殺傷曲線

結(jié)果如表1所示，初選質(zhì)量濃度梯度為5 μg/mL，結(jié)果顯示紅霉素質(zhì)量濃度為5 μg/mL時，S.thermophilus能夠生長，紅霉素質(zhì)量濃度為10 μg/mL時，S.thermophilus不能生長，說明S.thermophilus對紅霉素比較敏感，降低濃度梯度為2.5 μg/mL，在質(zhì)量濃度達到7.5 μg/mL時S.thermophilus不能生長，因此，后續(xù)實驗紅霉素抗性平板質(zhì)量濃度為7.5 μg/mL。

表1 紅霉素對S.thermophilus的影響Table 1 Effect of S. thermophilus by erythrocin

2.2 甘氨酸對S. thermophilus轉(zhuǎn)化率的影響

結(jié)果顯示甘氨酸會影響S.thermophilus的生長(圖1-A)，培養(yǎng)基中的Gly添加量不同，對S.thermophilus的生長影響程度不同，Gly添加量與細胞的生長速率呈現(xiàn)負相關(guān)，即甘氨酸添加量越高，細胞生長越緩慢，分析培養(yǎng)12 h的S.thermophilus生長結(jié)果，Gly添加量為10～40 g/L的培養(yǎng)基中S.thermophilus的生長速率為在正常培養(yǎng)基中的74.6%、42.3%、29.8%和24.1%；當Gly添加量達到50 g/L時，S.thermophilus基本不生長。

選取各組菌株對數(shù)生長期(OD600≤0.7)，制作感受態(tài)細胞，未添加Gly、Gly添加量為30和40 g/L的實驗組，其轉(zhuǎn)化效率為0；Gly添加量為10 g/L的實驗組，轉(zhuǎn)化效率最高，結(jié)果見圖1-B，可能由于Gly在菌體生長過程中取代肽鏈上的L-丙氨酸和D-丙氨酸，影響由雙糖單位(N-乙酞葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸)、短肽鏈和肽橋組成的肽聚糖的結(jié)構(gòu)[25]，這種替代造成了丙氨酸與尿苷二磷酸胞壁酸的連接，而酶因無法識別底物而受阻，使得合成含Gly的肽聚糖前體物積累,破壞了細胞壁生長過程中肽聚糖合成與酶水解的平衡。因此合成的肽聚糖有缺陷,使得細胞壁變得疏松[26]。但Gly添加量過大會導致菌體死亡，后續(xù)實驗選擇Gly的添加量為10 g/L。

圖1 甘氨酸濃度對菌體生長(A)及轉(zhuǎn)化效率(B)的影響Fig.1 Effect on cell growth (A) and conversion efficiency (B) under different glycine content注：圖中不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05。下同。

2.3 菌體生長時期對電轉(zhuǎn)化效率的影響

如圖2所示，細菌在不同生長時期的轉(zhuǎn)化效率不同，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。利用生長初期細胞(OD600<0.8)制作的感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化效率隨OD值的增加而上升；當OD600=0.8時，轉(zhuǎn)化效率達到最高，可產(chǎn)生近120個轉(zhuǎn)化子；利用對數(shù)生長期后期細胞(OD600>0.8)制作的感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化效率隨OD值的增加而下降，由于在OD600=0.8時，細胞處于最旺盛的生長階段，細胞活力最高，代謝旺盛，細胞壁結(jié)構(gòu)相對松散，電擊時易于形成空洞，有效轉(zhuǎn)化菌株量多，隨著生長時間的增加，細胞逐漸衰亡而使轉(zhuǎn)化菌株量減少[27]，因此后續(xù)實驗選擇將S.thermophilus培養(yǎng)至OD600=0.8制作感受態(tài)細胞。

圖2 細菌不同生長時期對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of growth phase on transformation efficiency

2.4 電壓對電轉(zhuǎn)化效率的影響

結(jié)果如圖3所示，電壓對轉(zhuǎn)化率的影響總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，轉(zhuǎn)化電壓相對較低時(1.4～1.8 kV)，細胞難以極化產(chǎn)生孔洞，DNA不能進入，隨著電壓的升高[28]，轉(zhuǎn)化效率隨之增大，電壓達到1.8 kV 時，轉(zhuǎn)化效率最高，如果轉(zhuǎn)化電壓繼續(xù)增大，細胞會因細胞膜損傷過大而死亡，轉(zhuǎn)化效率反而呈下降趨勢[29]，因此后續(xù)實驗選擇轉(zhuǎn)化電壓為1.8 kV。

圖3 不同電壓對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of voltage on transformation efficiency

2.5 質(zhì)粒濃度對電轉(zhuǎn)化效率的影響

結(jié)果如圖4所示，在質(zhì)粒質(zhì)量濃度為0.2～1.0 g/L時，電轉(zhuǎn)化效率隨著質(zhì)粒濃度增大而提高，質(zhì)粒質(zhì)量濃度達到1.0 g/L時電轉(zhuǎn)化效率最高，隨后在質(zhì)粒質(zhì)量濃度為1.0～1.6 g/L時，電轉(zhuǎn)化效率隨著質(zhì)粒濃度的增大而降低，質(zhì)粒質(zhì)量濃度在1.0 g/L時達到飽和，再增加質(zhì)粒濃度會阻塞細胞孔洞，從而使轉(zhuǎn)化菌株減少，高玲等在多黏類芽孢桿菌JSa-9電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化試驗中，所得的質(zhì)粒添加量對轉(zhuǎn)化菌株的影響也呈此趨勢[30]。因此后續(xù)實驗選擇質(zhì)粒質(zhì)量濃度為1.0 g/L。

圖4 不同濃度質(zhì)粒對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of differentcontent of plasmid on transformation efficiency

2.6 電轉(zhuǎn)緩沖液對電轉(zhuǎn)化效率的影響

將S.thermophilus接入含10 g/L Gly的M17培養(yǎng)基中，接種量為1%，37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.8，選擇不同電轉(zhuǎn)緩沖液(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和100 g/L甘油)制作感受態(tài)細胞，配制1.0 μg/μL質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化，用1.8 kV電壓進行電轉(zhuǎn)化，研究不同電轉(zhuǎn)緩沖液對電轉(zhuǎn)化效率的影響。

如圖5所示，不同電轉(zhuǎn)緩沖液處理的感受態(tài)細胞電轉(zhuǎn)化率不同，用電轉(zhuǎn)緩沖液Ⅰ和Ⅱ處理的細胞，轉(zhuǎn)化效果較好，電轉(zhuǎn)緩沖液Ⅱ的處理效果優(yōu)于電轉(zhuǎn)緩沖液Ⅰ；電轉(zhuǎn)緩沖液Ⅳ處理的感受態(tài)細胞，在轉(zhuǎn)化時發(fā)生了擊穿的現(xiàn)象，可能由于電擊介質(zhì)的電阻過低造成了這種現(xiàn)象；電轉(zhuǎn)緩沖液Ⅲ和100 g/L甘油處理的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化率為0，說明這2種電轉(zhuǎn)緩沖液不能使S.thermophilus形成感受態(tài)，后續(xù)實驗選擇電轉(zhuǎn)緩沖液Ⅱ作為電轉(zhuǎn)化緩沖液。

圖5 不同緩沖液對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of different buffer on transformation efficiency

3 結(jié)論

S.thermophilus紅霉素的敏感閾值為7.5 μg/mL，甘氨酸添加量、菌體生長時期、轉(zhuǎn)化電壓、質(zhì)粒質(zhì)量濃度和電轉(zhuǎn)緩沖液均影響S.thermophilus的轉(zhuǎn)化效率，本研究選擇甘氨酸質(zhì)量濃度為10 g/L、菌體生長至OD600=0.8、轉(zhuǎn)化電壓為1.8 kV、質(zhì)粒質(zhì)量濃度為1.0 g/L、 選擇電轉(zhuǎn)緩沖液Ⅱ。本研究為后續(xù)構(gòu)建嗜熱鏈球菌基因工程菌株奠定了一定的基礎(chǔ)。