滿麗莉，向殿軍

1(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼，028042)2(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼，028042)

血栓形成是由大量纖維蛋白和血小板異常凝聚引起的，與心肌梗死、腦梗塞和中風(fēng)等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病[1-2]。納豆在發(fā)酵過程中納豆菌會產(chǎn)生一種堿性絲氨酸蛋白酶—納豆激酶，該酶最早于1987年由日本的須見洋行等發(fā)現(xiàn)，其在體內(nèi)體外均為一種有效的溶栓酶，它不僅直接降解纖維蛋白，而且可促進(jìn)細(xì)胞釋放組織纖溶酶原激活物，降解纖維蛋白酶，納豆激酶是納豆、豆豉等發(fā)酵食品的主要功能成分，作為溶栓藥物的應(yīng)用備受關(guān)注[3-4]。與臨床溶栓藥物(尿激酶和鏈激酶等)相比，納豆激酶具有安全、低成本、易口服、易吸收、不易導(dǎo)致出血傾向、并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的綠色溶栓藥物，具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景[5-6]。納豆激酶除具有溶解血栓作用外，還具有抑制血小板凝固、降血壓、改善血流等多種生理功能，因此，納豆激酶相關(guān)產(chǎn)品(如納豆激酶藥品、納豆激酶保健品及功能性食品等)的開發(fā)引起了世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注[7-8]。

納豆激酶高產(chǎn)菌株的來源較為廣泛，如納豆、豆豉、中國豆醬、韓國的Chungkook-Jang和Doen-Jang等[4]，菌株篩選是研究納豆激酶特性、純化、應(yīng)用等的基礎(chǔ)，對納豆激酶特性的深入研究有利于保障人民的身體健康，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會效益。

本研究以市售納豆、豆豉及自然發(fā)酵納豆為供試樣品，篩選溶栓酶高產(chǎn)菌株，通過個體形態(tài)、菌落形態(tài)及16S rDNA基因同源性比對確定菌株屬種，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、多序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建、聚丙烯酰胺凝膠電泳、發(fā)酵曲線測定進(jìn)一步研究納豆激酶相關(guān)特性，為更好地實(shí)現(xiàn)納豆激酶的開發(fā)及應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品及模式菌株

供試樣品為市售的商品化納豆、豆豉及自然發(fā)酵納豆。模式菌株，枯草芽孢桿菌1.108 6購自中科院北京微生物研究所。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

凝血酶，購自中國藥品生物制品檢定所；纖維蛋白原和瓊脂糖，購自美國Sigma公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；Marker、Taq聚合酶等，購自寶生物工程(上海)有限公司；其他藥品均為國產(chǎn)分析純。

酪蛋白高鹽平板(g/L)：酵母提取物5，酪蛋白10，NaCl 40，瓊脂20，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，NaCl 5，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

MJ-54A/MJ-78A型STIK滅菌鍋，北京天賜科儀商貿(mào)有限公司；Microfuge16型離心機(jī)，美國貝克曼公司；WS-600型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，德國Wiggens公司；110-801型三量ip67防水原點(diǎn)數(shù)顯卡尺不銹鋼零點(diǎn)電子游標(biāo)尺，東莞市景有模具五金有限公司；9700 PCR儀，美國Applied Biosystems公司；DYY-10C型電泳儀及DYCZ-28A型電泳槽，北京市六一儀器廠；1708195型凝膠成像系統(tǒng)，伯樂(Bio-Rad)公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)及發(fā)酵方法

培養(yǎng)方法：挑取菌株接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h(OD600=1.5～1.6)。

發(fā)酵方法：將菌液按5%接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h后，發(fā)酵液以5 000×g離心10 min后，取10 μL上清液用于納豆激酶活性的測定。

1.2.2 納豆激酶活力的測定

納豆激酶活力的測定采用纖維蛋白平板法[9]。溶圈直徑采用電子游標(biāo)卡尺測定。

1.2.3 納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定

1.2.3.1 菌種的分離及篩選

將6～8粒供試樣品放入無菌試管中，經(jīng)10 mL無菌水洗滌分裝于離心管中，5 000×g離心10 min，收集菌體，用無菌生理鹽水懸起，95 ℃水浴5 min，將菌液進(jìn)行10倍的梯度稀釋，取10-3、10-4、10-5分別吸取100 μL菌液涂布于酪蛋白高鹽平板，37 ℃培養(yǎng)36 h，電子游標(biāo)卡尺測定透明圈大小，在每個培養(yǎng)皿中選擇透明圈/菌落比值大的菌落挑菌，經(jīng)反復(fù)純化后保藏。挑取菌株按1.2.1方法培養(yǎng)發(fā)酵測定納豆激酶活性，溶圈直徑最大的菌株用于進(jìn)一步研究。

1.2.3.2 納豆激酶高產(chǎn)菌株的鑒定

通過菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生理生化鑒定和16S rDNA 基因序列測定進(jìn)行菌株的鑒定。比較分離菌株及模式菌株在固體種子培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、革蘭氏染色后的菌體形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(第八版)》進(jìn)行菌株的初步鑒定。

應(yīng)用細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行菌體DNA的提取，通過PCR擴(kuò)增16S rDNA基因序列進(jìn)一步鑒定菌株。根據(jù)GenBank中已公布的枯草芽孢桿菌的16S rDNA 基因序列(序列號分別為AY219900.1、EF423598.1、JN399219.1、EF528288.1、DQ416796.1、JX402129.1、JQ435698.1、AB188212.1、HM030757.1)設(shè)計(jì)引物，上游引物(MX-6-16S rDNA-F)：5′-AGAGKTTGAWYMTGGCTCAGGA CG-3′，下游引物(MX-6-16S rDNA-R)：5′-ARGGAGGTGATCCAGCCRCACCTT-3′。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳(100 V)檢測，送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。利用NCBI中的Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，將所測定的序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對。

1.2.4 納豆激酶編碼基因aprN的克隆

根據(jù)GenBank中已公布的納豆激酶編碼基因aprN序列設(shè)計(jì)引物，上游引物aprN-F(5′-GTATGAAAATAGTTATTTCGAGTCTC-3′)和下游引物aprN-R(5′-TCCGGTGCTTGTGAAG ATTTTCAGA-3′)用于克隆枯草芽孢桿菌MX-6中的aprN基因。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳(100 V)檢測，送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。利用NCBI中的Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)將所測定的序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，系統(tǒng)進(jìn)化樹用MEGA 6.0構(gòu)建，氨基酸多序列比對利用Clustal X進(jìn)行，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量用ExPASy的ProtParam tool在線程序預(yù)測。

1.2.5 納豆激酶的分子質(zhì)量測定

枯草芽孢桿菌MX-6采用1.2.1方法獲得納豆激酶發(fā)酵上清液。上清液經(jīng)過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow及CM-Sepharose Fast Flow層析和Sephadex G-75凝膠過濾實(shí)現(xiàn)納豆激酶的純化。純化的納豆激酶的相對分子質(zhì)量通過SDS-PAGE測定[10]。

1.2.6 枯草芽孢桿菌MX-6產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵曲線

枯草芽孢桿菌MX-6采用1.2.1方法培養(yǎng)，將菌液按體積分?jǐn)?shù)5%接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)102 h后，每隔6 h取樣，發(fā)酵液經(jīng)5 000×g離心10 min 后，取10 μL上清液用于納豆激酶活性的測定。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

納豆激酶活性的測定數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 17.0軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株的分離及篩選

應(yīng)用酪蛋白高鹽平板從商品化的納豆、豆豉及自然發(fā)酵納豆中分離出60株產(chǎn)蛋白酶菌株，應(yīng)用纖維蛋白平板法篩選出4株纖溶酶活性明顯較高的菌株(P<0.01)，分別命名為菌株MX-1、MX-3、MX-5、MX-6，其中分離于豆豉中的菌株MX-6纖溶酶活性最高，溶圈直徑達(dá)到(21.60±0.48)mm，將菌株MX-6應(yīng)用于進(jìn)一步的研究。

2.1.2 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)鑒定

與模式菌株-枯草芽孢桿菌1.108 6相比，不同點(diǎn)在于菌株MX-6的菌落直徑較大，菌落形狀為不規(guī)則圓形，邊緣呈現(xiàn)波狀，中央凸起，有褶皺，孢子位于端生或偏端生(表1)。

表1 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of colony morphology and bacterial morphology

2.1.3 生理生化鑒定

通過革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陽性及其他生理生化鑒定結(jié)果顯示，菌株MX-6符合枯草芽孢桿菌屬的典型特征。與模式菌株相比較，不同點(diǎn)在于菌株MX-6的D-甘露醇實(shí)驗(yàn)為陰性，其他生理生化鑒定結(jié)果均與模式菌株相同(表2)，且都具有較好的耐鹽性和耐熱性，此結(jié)果可說明菌株MX-6屬于枯草芽孢桿菌屬。

表2 生理生化鑒定結(jié)果Table 2 The results of physiological and biochemical identification

注：“+”或“-”分別表示生化反應(yīng)(或革蘭氏染色)為陽性或陰性。

2.1.4 菌株的16S rDNA基因序列分析

以菌株MX-6的總基因組DNA為模板，應(yīng)用簡并引物MX-6-16S rDNA-F和MX-6-16S rDNA-R擴(kuò)增16S rDNA基因片段，獲得的序列片段長度為1 542 bp(圖1)，其序列與GenBank中已公布的枯草芽胞桿菌IAM 12118(NR112116.1)和枯草芽孢桿菌168(NR102783.1)的16S rDNA基因序列同源性高達(dá)99%以上，進(jìn)一步證明菌株MX-6為枯草芽孢桿菌，其16S rDNA基因序列已提交到GenBank，序列號為KY575151。

M-DNA Marker Ⅲ；1-16S rDNA的PCR產(chǎn)物圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定菌株MX-6的16S rDNA基因Fig.1 Identification of16S rDNA gene in strain MX-6 by agarose gel electrophoresis

2.2 納豆激酶編碼基因aprN的克隆及序列分析

以枯草芽孢桿菌MX-6的總基因組DNA為模板，根據(jù)GenBank中已公布的納豆激酶編碼基因aprN序列設(shè)計(jì)引物，PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，以DNA Marker Ⅲ為對照，在1 473 bp處獲得1條特異性條帶(圖2)，測序結(jié)果與GenBank中枯草芽胞桿菌29R(CP017763.1)、枯草芽孢桿菌KH2(CP018184.1)及納豆芽孢桿菌CGMCC 2108(CP014471.1)的aprN基因序列的同源性高達(dá)99%，表明克隆到的aprN基因序列的正確性。將克隆測序得到的aprN基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列號為KY576911?？莶菅挎邨U菌MX-6的aprN基因序列長度為1 473 bp，開放閱讀框?yàn)? 152 bp，起始密碼子為GTG，終止序列包括3個終止密碼子(TAA、TAG、TAA)。

M-DNA Marker Ⅲ；1-aprN的PCR產(chǎn)物圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定枯草芽孢桿菌MX-6的aprN基因Fig.2 Identification of aprN gene in Bacillus subtilis MX-6 by agarose gel electrophoresis

與枯草芽孢桿菌LSSE-22所產(chǎn)納豆激酶的結(jié)構(gòu)相一致[11]，由推斷獲得的381個氨基酸組成的閱讀框架包括29個氨基酸組成的信號肽、77個氨基酸組成的前導(dǎo)肽及275個氨基酸組成的成熟肽。預(yù)測分子質(zhì)量為27 712.72 u。推斷的氨基酸序列與已公布枯草芽孢桿菌納豆激酶序列(AA065246.1)的同源性高達(dá)99%，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌MX-6所產(chǎn)的纖溶酶為納豆激酶。氨基酸多序列比對結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌MX-6的溶栓酶序列與已知的溶栓酶序列具有高度保守性，與枯草芽胞桿菌的納豆激酶序列(WP 014479360.1)僅相差1個氨基酸殘基(圖3)。由系統(tǒng)進(jìn)化樹可知(圖4)，枯草芽孢桿菌MX-6的纖溶酶與枯草芽孢桿菌納豆激酶NAT(WP 014479360.1)、枯草芽孢桿菌納豆激酶前體(AA065246.1)、枯草芽孢桿菌納豆激酶E(WP 009966941.1)同在一個進(jìn)化分支上，可進(jìn)一步確定枯草芽孢桿菌MX-6所產(chǎn)的纖溶酶為納豆激酶。

2.3 納豆激酶的相對分子質(zhì)量測定

發(fā)酵上清液經(jīng)40%～60%硫酸銨分段沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow及CM-Sepharose Fast Flow層析及Sephadex G-75凝膠過濾獲得純化納豆激酶，純度提高53.4倍，回收率達(dá)到11.7%，純化納豆激酶可用于進(jìn)行SDS-PAGE。SDS-PAGE結(jié)果顯示在約28 ku獲得單一條帶(圖5)，與預(yù)測的相對分子質(zhì)量27 712.72 u相吻合。相關(guān)研究顯示，微生物纖溶酶的相對分子質(zhì)量在14～52 ku，枯草芽孢桿菌MX-6所產(chǎn)納豆激酶的相對分子質(zhì)量在此范圍內(nèi)[12]，其相對分子質(zhì)量測定結(jié)果(約28 ku)與DABBAGH等的研究結(jié)果(27.7 ku)相一致[7]，而與LU等(118 ku和49 ku)[13]、KOTB等(18.2 ku)[14]和ZHANG等(約31 ku)[9]的研究結(jié)果不同，溶栓酶相對分子質(zhì)量的差異可能是由于菌株屬種不同所造成。

圖3 枯草芽孢桿菌MX-6的纖溶酶序列與已知的纖溶酶序列的多序列比對結(jié)果Fig.3 Comparison results of plasminogen sequence of Bacillus subtilis MX-6 with known plasminogen sequence注：MX6-枯草芽孢桿菌MX-6的纖溶酶；Bs-枯草芽孢桿菌納豆激酶NAT(WP 014479360.1)；Bm-莫海威芽孢桿菌肽酶S8(WP 010333625.1)；Bh-耐鹽短桿菌肽酶S8(WP 044156525.1)；Bv-死谷芽孢桿菌肽酶S8(WP 010329279.1)；Bl-地衣芽孢桿菌酶AprE 3-17(ACU32756.1)；Bn-納卡穆雷芽孢桿菌肽酶(WP 061521470.1)。

圖4 枯草芽孢桿菌MX-6的纖溶酶與同源纖溶酶構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of plasminogen in Bacillus subtilis MX-6 and homologous plasminogens

1-粗酶液；2-純化納豆激酶圖5 粗酶液及純化納豆激酶的SDS-PAGE結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE result of crude enzyme and purified nattokinase

2.4 枯草芽孢桿菌MX-6產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵曲線

由圖6可知，在0～12 h枯草芽孢桿菌MX-6所產(chǎn)納豆激酶的合成量較低，在12～72 h，納豆激酶的合成量快速增加，72 h達(dá)到最高合成量，溶圈直徑達(dá)到21.60 mm。在72～102 h納豆激酶的合成量呈現(xiàn)下降趨勢。

圖6 枯草芽孢桿菌MX-6所產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵曲線Fig.6 Fermentation curve of nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

3 結(jié)論

由于16S rDNA基因在菌株進(jìn)化過程中具有高度保守性，結(jié)合PCR技術(shù)可建立基于16S rDNA序列來確定其生物分類的方法，此法具有快捷、方便、準(zhǔn)確等優(yōu)勢，可有效地分析不同菌株種內(nèi)差異，是細(xì)菌分類研究中最有效的方法之一[15]。本研究結(jié)合菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生理生化鑒定及16S rDNA基因同源性比對結(jié)果準(zhǔn)確鑒定了菌株MX-6為枯草芽孢桿菌。

目前，具有溶栓活性的蛋白酶除了納豆激酶之外，還有許多其他的酶類如subtilisin DJ-4、subtilisin DFE、纖維蛋白分解酶BSF1等，由于納豆激酶編碼基因aprN具有高度保守性[11]，為了進(jìn)一步確定枯草芽胞桿菌MX-6所產(chǎn)溶栓酶是否為納豆激酶，根據(jù)GenBank中已公布的納豆激酶編碼基因aprN序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)克隆獲得一條特異性條帶，結(jié)合測序、多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果確定枯草芽胞桿菌MX-6所產(chǎn)的溶栓酶為納豆激酶。SDS-PAGE獲得納豆激酶的分子質(zhì)量約28 ku，與預(yù)測的分子質(zhì)量277 12.72 u相吻合，表明檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究可為納豆激酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定一定的理論與技術(shù)參考。