蘇文英，楊和川，譚一羅，李 曉，付永平*，李 玉*

(1.連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222006；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食藥用菌教育部工程中心，吉林 長春 130118)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為基因組改造和基因功能研究的熱點。早期僅基于同源重組的基因打靶技術(shù)效率比較低，限制了基因打靶技術(shù)的應(yīng)用。后來，研究者們用改造過的人工核酸內(nèi)切酶(Engineered Endonuclease，EEN)在基因組的特定位置使DNA雙鏈斷裂，并在修復(fù)過程中達到基因定點編輯的作用，人工核酸內(nèi)切酶的出現(xiàn)，徹底改變了基因編輯效率低的這一現(xiàn)狀[1]。早期的EEN介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)主要包括鋅指核酸內(nèi)切酶技術(shù)(Zinc-finger Nucleases，ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(Transcription Activator-like Effector Nucleases，TALEN)，這2種技術(shù)的作用原理都是通過DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶Fok Ⅰ組成蛋白復(fù)合物對靶點進行特異性的識別和切割[2]。然而，這2項技術(shù)在操作過程中不僅費時費力，而且對操作技術(shù)要求很高，因而在普通實驗室很難被有效利用。2013年初，新型基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas系統(tǒng)進入人們的視野[3]，因其制作成本低廉、操作過程簡單、快捷且易于掌握的特點，迅速在作物品種改良[4-8]、動物模型構(gòu)建[9-10]、疾病治療研究[11-13]、發(fā)酵菌株代謝途徑改造[14-15]等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。但在真菌中，由于部分真菌同源重組率極低、高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的缺乏、啟動子和有效篩選標記的缺乏等原因，阻礙了該技術(shù)在真菌中的發(fā)展。本文綜述了近幾年CRISPR/Cas9技術(shù)在真菌中的開發(fā)和應(yīng)用，以期為進一步加快真菌基因編輯研究提供參考。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及其作用原理

1.1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)概述

1987年，日本學(xué)者首次在大腸桿菌(Escherichiacoli)堿性磷酸酶基因(Alkaline Phosphatase，IAP)的側(cè)翼序列中發(fā)現(xiàn)了成簇的有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列[17]；Jansen等[18]將其正式命名為成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)。之后，研究者發(fā)現(xiàn)在40%的細菌和90%的古細菌的基因組中都存在CRISPR位點[19]。Barrangou等[20]對嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)進行遺傳改造時，發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌的CRISPR/Cas Ⅱ型系統(tǒng)能夠抵抗外源噬菌體的入侵。隨著研究的進一步深入，Marraffini等[21]發(fā)現(xiàn)細菌中的CRISPR系統(tǒng)能抵御外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，并通過實驗驗證了CRISPR系統(tǒng)的功能。Feng Zhang團隊的Cong L等[22]和George M. Church團隊的Mali P等[23]同時在《Science》雜志上在線報道了應(yīng)用sgRNA介導(dǎo)的Cas9核酸酶對哺乳動物細胞基因組的特異性打靶。此后，利用該技術(shù)在不同生物中進行基因編輯的工作陸續(xù)展開。

1.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的作用原理

由于Cas基因的多樣性異常豐富，研究者根據(jù)Cas基因核心元件序列的不同，將CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)分為Type Ⅰ、Type Ⅱ、Type Ⅲ共3種不同類型。TypeⅠ系統(tǒng)主要存在于細菌和古生菌中，結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，特征蛋白為Cas3 蛋白，該蛋白具有解旋酶和核酸酶功能[24]；Type Ⅲ系統(tǒng)的特征蛋白為Cas10 蛋白，該蛋白具有RNA 酶活性[25]。而在這3種不同類型中，由于Type Ⅱ型系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)簡單，除去crRNA和tracrRNA外，只有一個標志性Cas9蛋白來切割DNA雙鏈，并且它僅存在于細菌中[26]。因此到目前為止，被改造的最為成功的人工核酸內(nèi)切酶是產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes，SF370)的Type Ⅱ型系統(tǒng)，并且已經(jīng)在多種生物中成功實現(xiàn)了基因組定點修飾。

CRISPR/Cas的組織結(jié)構(gòu)相對簡單。以產(chǎn)膿鏈球菌SF370的Type Ⅱ型結(jié)構(gòu)為例，其結(jié)構(gòu)可被分為3個部分：第一部分為5′端的轉(zhuǎn)錄激活RNA(tracrRNA)基因；第二部分為中間一系列與CRISPR相關(guān)的Cas(CRISPR-associated)蛋白，目前發(fā)現(xiàn)有6個核心Cas蛋白，包括Cas9、Cas1、Cas2、Csn2，其中Cas9蛋白包含2個獨特的功能結(jié)構(gòu)域HNH和類RuvC核酸酶亞基，它們分別切割DNA雙鏈，從而產(chǎn)生基因定點突變；第三部分為3′端的CRISPR基因座，由前導(dǎo)區(qū)(Leader)、間隔區(qū)(Spacers)以及多個重復(fù)序列(Direct repeats)順序連接而成[27]。

CRISPR/Cas9的作用機理大體可以分為3個步驟：(1)外源質(zhì)粒上與CRISPR基因座上對應(yīng)的序列被稱為protospacer，它的5′端或3′端的3～5個保護堿基，被稱為PAM(Protospacer Adjacent motif)序列。當外源質(zhì)粒入侵時，通過識別PAM序列來將其附近的序列定為protospacer，然后該序列被整合到CRISPR基因座的兩個重復(fù)序列間，即獲得間隔序列；(2)當外源質(zhì)粒再次入侵時，CRISPR基因座與插入的新間隔序列首先被轉(zhuǎn)錄成長的前體RNA(pre-crRNA)，然后在Cas蛋白和RNase Ⅲ核酸酶的作用下被加工成含有間隔序列的crRNA；(3)然后，crRNA與特異的Cas蛋白以及轉(zhuǎn)錄激活RNA tracrRNA形成復(fù)合物crRNA- tracrRNA，再通過PAM序列掃描外源入侵DNA上的靶序列，crRNA上的間隔序列與靶序列進行互補配對，最后Cas9蛋白發(fā)揮切割酶活性，外源噬菌體或是質(zhì)粒DNA在配對的特定位置被切割，從而達到防御的目的[28]。具體的作用機理如圖1所示。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在真菌中的應(yīng)用

2.1 在酵母菌中的應(yīng)用

2.1.1 釀酒酵母 早在2013年，DiCarlo等[30]就將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用到了釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，研究者將攜帶 sgRNA的質(zhì)粒與供體DNA同時轉(zhuǎn)至含有組成型表達的Cas9細胞中，使供體DNA的同源重組率接近100%，而且相較于傳統(tǒng)的同詢重組技術(shù)，該技術(shù)使單鏈及雙鏈靶基因斷裂效率分別提高5倍和130倍，該研究為后續(xù)酵母基因定點突變和等位基因替換研究提供了強有力的支撐。隨后，Bao等[31]構(gòu)建了一步實現(xiàn)多基因敲除的CRISPR-Cas系統(tǒng)——HI-CRISPR(Homology-Integrated CRISPR-Cas)，在對釀酒酵母進行基因編輯時，其中3種基因CAN1、ADE2、LYP1在4 d內(nèi)同時被破壞，效率為27%～87%；另外3個基因ATF2、GCY1、YPR1在6 d內(nèi)同時被破壞，效率為100%，該研究實現(xiàn)了在釀酒酵母中進行多基因編輯，大大提高了基因編輯效率。

2.1.2 裂殖酵母 裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)與真核生物基因組的相似性高于釀酒酵母，但由于分子工具的缺乏，關(guān)于裂殖酵母的研究不如釀酒酵母深入。特別是由于缺乏用于表達sgRNA的啟動子而阻礙了CRISPR/Cas9基因組編輯體系在裂殖酵母中的實施。2014 年，Jacobs 等[32]開發(fā)了應(yīng)用于裂殖酵母中的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在該研究中研究者利用RNA(rrk1)的啟動子構(gòu)建靶向指導(dǎo)RNA的表達載體，與組成型Cas9相結(jié)合，在裂殖酵母中實現(xiàn)無篩選標記的特異性誘變，誘變效率接近100%，實現(xiàn)了在裂殖酵母中進行特定、精確和高效的基因組編輯。

圖1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機理[29]

2.1.3 白色假絲酵母 Shapiro等[33]建立了一種基于CRISPR/Cas9的基因驅(qū)動平臺(Gene Drive Array，GDA)，能夠在二倍體病原體中進行基因操作及快速形成突變體，該研究被用于對白色假絲酵母(Candidaalbicans)高效基因編輯中，在此研究中，一種DNA切割的Cas9酶靶向2個區(qū)域，位于單倍體白色念珠菌真菌中一個基因的兩側(cè)，由兩個所謂的“向?qū)?RNA”(gRNAs) 基因組成。在靶向基因序列被切斷后，一種基因驅(qū)動的盒式表達，將所有的 Cas9 和 gRNA 組件插入其位置。當2個單倍體菌類交配形成二倍體后代時，基因驅(qū)動也將替代基因在另一個染色體上的對應(yīng)基因，得到目標基因有效地從機體完全刪除的原始版本。這項研究為了解白色念珠菌致病機制和耐藥性提供了新的途徑。

2.2 在霉菌中的應(yīng)用

2.2.1 里氏木霉 2015年，Liu等[34]通過特定的密碼子優(yōu)化和體外RNA轉(zhuǎn)錄，融合增強的綠色熒光蛋白(eGFP)對其進行檢測，建立了適用于絲狀真菌里氏木霉(Trichodermareesei)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，不僅可以在同源臂較短的條件下實現(xiàn)靶基因高效率的同源重組，也可對多個靶基因進行同時編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在里氏木霉中的成功應(yīng)用，為進一步加速絲狀真菌的功能基因組學(xué)和菌株改良研究奠定了基礎(chǔ)。

2.2.2 米曲霉 Katayama等[35]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對工業(yè)菌株米曲霉(Aspergillusoryzae)基因組進行了編輯，在該研究中研究者利用amyB作為Cas9的啟動子，來自米曲霉的U6 啟動子作為gRNA 啟動子，SV40作為核定位信號，F(xiàn)LAG-tag作為蛋白表達與否的檢驗標記，構(gòu)建了靶向于wA、yA、pyrG基因的載體，突變率在10%～20%之間，結(jié)果表明：單堿基的缺失或插入突變較多，且不會對米曲霉的生長造成影響。該技術(shù)在米曲霉中的應(yīng)用有利于后續(xù)米曲霉定向誘變研究。

2.2.3 煙曲霉 Zhang等[36]在煙曲霉(Aspergillusfumigatus)中建立了以 CRISPR/Cas9 技術(shù)為基礎(chǔ)的微生物學(xué)介導(dǎo)的末端連接(Microhomology-Mediated End Joining，MMEJ)靶基因突變系統(tǒng)，不僅實現(xiàn)了精確高效的靶基因編輯，并且通過35 bp的同源臂就可使基因的編輯效率高達95%～100%。

2.2.4 水稻稻瘟病菌 在水稻稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)中，Arazoe等[37]分別利用內(nèi)源性的 RNA 聚合酶Ⅲ(RNA polymerase, RNAP)所識別的U6啟動子和 RNA 聚合酶Ⅱ控制的TrpC啟動子表達 sgRNA，同時發(fā)現(xiàn)利用RNA聚合酶Ⅲ識別的U6啟動子比利用 RNA 聚合酶Ⅱ識別的TrpC啟動子進行基因組編輯的效率更高，這表明驅(qū)動sgRNA的啟動子也會影響敲除效率。

2.2.5 玉米黑粉菌 在玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)中，Schuster等[38]使用密碼子優(yōu)化的Cas9蛋白、組成型強啟動子Potef、gRNA以及來源于自身的U6 啟動子構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯體系，通過單步轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入，對基因bE2和bW1進行編輯，結(jié)果表明：突變效率高達70%，為后續(xù)玉米黑粉菌致病基因功能的研究提供了很大的幫助。

2.3 在蕈菌中的應(yīng)用

2.3.1 雙孢蘑菇 2016年賓夕法尼亞大學(xué)的楊亦農(nóng)教授利用該技術(shù)對雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)中控制褐變的多酚氧化酶(PPO)的基因進行了基因編輯，并將該酶的活性降低了30%，使其抗褐變。此研究雖然沒有公開具體操作過程，但這是基因編輯技術(shù)在大型真菌中的首次應(yīng)用[39]。

2.3.2 灰蓋鬼傘 2017年，Sugano 等[40]構(gòu)建了應(yīng)用于大型真菌模式生物灰蓋鬼傘(Coprinopsiscinerea)中的高效的基因組編輯體系，在此研究中，作者利用高通量轉(zhuǎn)化方法篩選獲得的一個活性高出常規(guī)啟動子GPD活性7倍的新啟動子——CcDED1pro，然后將該啟動子作用于Cas9蛋白，來自灰蓋鬼傘的U6-snRNA啟動子表達gRNA，構(gòu)建載體，利用PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化冷凍保存的原生質(zhì)體。最后，利用上述體系在穩(wěn)定的 GFP 表達體系中進行 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的 GFP 誘變，并在菌絲和子實體中成功檢測到了GFP 功能的喪失。該研究加速了大型真菌遺傳及分子育種研究。

2.3.3 金針菇 劉建雨等[41]將SpCas9根據(jù)金針菇(Flammulinavelutipes)密碼子偏好性進行了密碼子優(yōu)化并合成FvCas9全長序列，構(gòu)建了FvCas9雙元表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化金針菇單核體Dan3，并成功獲得了轉(zhuǎn)化子。

2.3.4 靈芝 Qin等[42]在靈芝(Ganodermalucidum)中成功應(yīng)用了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在此研究中，作者應(yīng)用T7啟動子表達gRNAs，來源于靈芝自身的Pgpd啟動子和來自里氏木霉的Tpdc終止子作用于Cas9，然后利用PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體，靶向破壞靈芝中阻礙靈芝酸合成的基因——URA3，并成功獲得了轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率高達66.6%，從而使靈芝產(chǎn)生更多具有抗腫瘤活性和抗轉(zhuǎn)移活性的靈芝酸。該研究為未來更高級真菌的深入研究和應(yīng)用提供了有效的平臺。

2.3.5 蛹蟲草 孫丹[43]將植物敲除載體pFGC-pco Cas9 通過PmeⅠ和NcoⅠ兩種限制性內(nèi)切酶將用于真菌的GPD啟動子成功地構(gòu)建到pFGC-pco Cas9中，從而成功改造了適用于真菌敲除的載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)原生質(zhì)體，得到關(guān)于URA3基因(gRNA1+gRNA2)的轉(zhuǎn)化子共 70+52個，其中g(shù)RNA1的突變率為2.8%，gRNA2突變率為2.0%。隨后，Chen等[44]通過密碼子偏好性對Cas9酶進行優(yōu)化，并將其與新報道的啟動子Pcmlsm3和終止子Tcmura3一起表達，構(gòu)建了應(yīng)用于蛹蟲草的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，并通過熒光GFP標簽和蛋白質(zhì)印跡分析證明該系統(tǒng)可以穩(wěn)定表達。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將體外合成的sgRNA和供體單鏈DNA(ssDNA)轉(zhuǎn)化蛹蟲草原生質(zhì)體，利用5-FOA作為篩選標記，并成功獲得轉(zhuǎn)化子。該研究為進一步提高蟲草素的產(chǎn)量，促進相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了技術(shù)支持。

隨著被成功測序的蕈菌數(shù)目的增加及實驗技術(shù)的進步，尋找子實體發(fā)育的關(guān)鍵基因，并探究不同基因的具體功能和參與的調(diào)控機制也變得越來越重要。目前CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在蕈菌中的應(yīng)用還比較少，且多集中在CRISPR/Cas9基因編輯體系的建立，并且突變體的篩選多依靠測序完成，工作量很大。相信隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷改進和完善，科學(xué)家們能夠建立一種高效簡便的CRISPR/Cas9基因編輯體系，為蕈菌功能基因挖掘、遺傳育種研究奠定基礎(chǔ)。

3 影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效率的因素

首先，該系統(tǒng)最大的問題就是脫靶率較高，CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的特異性取決于 sgRNA 上的識別序列，因此如何設(shè)計高效、特異性的sgRNA是降低脫靶效率的關(guān)鍵。研究表明，在設(shè)計sgRNA 時，高C/G含量百分比可以有效降低脫靶率[45]。在設(shè)計 gRNA 時，可通過特定算法預(yù)測潛在脫靶位點，盡可能選擇脫靶效應(yīng)低的 gRNA，現(xiàn)在已使用各種算法的專業(yè)軟件來降低脫靶效率，如Cas-OFFinder、CRISPR Design Tool、CasFinder、CHOPCHOP、CRISPOR、E-CRISPR等軟件。此外，研究發(fā)現(xiàn)降低sgRNA的濃度也有助于降低脫靶率[46]。另一項研究也表明，較長的 PAM 序列能夠有效地減少脫靶效應(yīng)[47]。

其次，同源臂的長短、質(zhì)粒的濃度、啟動子及篩選標記的選擇以及是否建立了高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系等因素都會影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率。Paix等[48]研究發(fā)現(xiàn)由33～38個核苷酸組成的同源臂與由518個核苷酸組成的同源臂成功率相當，最優(yōu)編輯條件下的成功率為10%～20%。Zhang等[36]在煙曲霉(Aspergillusfumigatus)中的研究也表明：通過35 bp的同源臂就可使基因的編輯效率高達95%～100%，并且使用gpdA或niiA等強啟動子驅(qū)動 Cas9的表達能有效提高敲除效率。Arazoe等[37]研究表明：采用U6啟動子表達 sgRNA進行基因編輯的效率高于tripC啟動子。這些研究都進一步表明不同來源的啟動子的靶標范圍、精準度和表達效率也不相同。

Matsuura等[49]發(fā)現(xiàn)，在一定的范圍內(nèi)，Cas9和gRNA載體的濃度越高，轉(zhuǎn)化效率越高。Schuster 等[38]認為在制備原生質(zhì)體時，如果采用混合的破壁酶將會導(dǎo)致脫靶率較高。此外，CRISPR/Cas9技術(shù)主要是通過基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的受體遺傳轉(zhuǎn)化法來實現(xiàn)將CRISPR/Cas9系統(tǒng)帶入到受體體內(nèi)。所以，穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系也是CRISPR/Cas9成功高效運用的因素之一。因此，在今后的應(yīng)用過程中，仍然要對這些影響基因編輯效率的因素進行進一步優(yōu)化，加速推動該技術(shù)在真菌中的應(yīng)用。

4 結(jié)語

綜上所述，利用 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)可以有效地對真菌的靶基因進行編輯，利用該體系不僅可以對單個的目的基因進行編輯，也可對基因家族、整個基因座及代謝通路中的多個基因同時進行編輯。并且與ZFN和TALEN這兩種傳統(tǒng)的人工核酸酶相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建簡單、方便、快捷，且對細胞毒性小。但是運用過程中出現(xiàn)的脫靶、編輯效率低以及突變體篩選工作量大等問題也亟待解決。相信在不久的將來，隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的改進和完善，真菌基因組的編輯將會變得越來越簡單，為進一步推進真菌功能基因組學(xué)及遺傳育種研究帶來突破性進展。