陳劍云 張 方 陽慧芝 陳嶸祎

淋病奈瑟菌(簡稱淋球菌)是一種革蘭陰性雙球菌，人類是唯一自然宿主。其主要侵犯泌尿生殖黏膜,引起宮頸、宮腔、尿道、輸卵管及盆腔感染，但女性患者大多表現(xiàn)為無癥狀，除了延誤治療引發(fā)不孕等嚴(yán)重后遺癥，更會加速淋病蔓延甚至促進(jìn)HIV感染。淋球菌感染的活菌數(shù)量是影響實驗效果的關(guān)鍵指標(biāo)，添加經(jīng)過定量的活菌有利于實驗效果的評估及提高實驗的可重復(fù)性，并有利于炎癥因子表達(dá)實驗條件的優(yōu)化。然而淋球菌感染實驗如何定量，淋球菌體外感染單核細(xì)胞對炎癥因子的影響，特別是IL-1β、NLRP3(核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3)表達(dá)的研究目前國內(nèi)未見報道。本文通過研究淋球菌定量方法以及不同濃度淋球菌感染單個核細(xì)胞對IL-1β、NLRP3表達(dá)的影響，為淋球菌感染致病機(jī)制研究及該病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株、C57/BL6J小鼠 淋球菌菌株，購于上海宜醇化工有限公司(菌種編號19424)，C57/BL6J小鼠，購于廣東省醫(yī)學(xué)動物中心。

1.1.2 主要儀器與試劑 SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo SCIENTIFIC公司)，高速低溫臺式離心機(jī)(美國Thermo公司)、VininTM7 Dx Real-Time PCR儀(Life)、倒置顯微鏡(CKX41，OLYMPUS)、分光光度計(德國Eppendorf公司)；小鼠單個核細(xì)胞分離液(LTS1092PK-200,天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)、淋球菌選擇培養(yǎng)基(15098，江門凱林公司)、澳洲源胎牛血清(10099-141，Gibco公司)、RPMI 1640完全培養(yǎng)基(C11875500BT，Gibco公司)、PBS, pH 7.2(20012-043，Gibco公司)、Trizol、qRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa)、SYBR? Premix ExTaqTMII(Tli RNaseH Plus)(RR820A，Takala公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌液OD值測定 將淋球菌接種于淋球菌選擇培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，用接種環(huán)挑取單個菌落于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中制成細(xì)菌懸液。以未加菌的培養(yǎng)液為空白對照液調(diào)零，波長450 nm測量OD值，選取OD值在0.6～1.0之間的菌液進(jìn)行1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0梯度稀釋，并測量其OD450值。

1.2.2 菌落平板計數(shù) 將各組菌液進(jìn)行10、102、……10n倍比稀釋，吸取1 mL稀釋后的菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。選取培養(yǎng)基上菌落數(shù)為30～300 CEU/mL為最佳稀釋倍數(shù)10n，準(zhǔn)確計數(shù)培養(yǎng)基上菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)10n，為1 mL菌液中的活菌數(shù)(CEU/mL)，即菌液中淋球菌活菌的濃度。

1.2.3 回歸方程計算 以菌落數(shù)為y值，菌液OD450值為x值，計算相關(guān)回歸方程。

1.2.4 小鼠脾臟單個核細(xì)胞獲取 于超凈工作臺中無菌操作取出C57/BL6J小鼠脾臟，以PBS漂洗2次后，以磨砂玻片輕輕研磨，用細(xì)胞篩過濾獲得細(xì)胞懸液4 mL。將細(xì)胞懸液移至已盛有單個核細(xì)胞分離液的濾液離心管中，細(xì)胞懸液與單個核細(xì)胞分離液體積之比為1∶4，以500×g離心30 mim，分四層，取上數(shù)第二層，即單個核細(xì)胞層。加入適量PBS液漂洗1次，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，吹打混勻2 min，再加入PBS漂洗1次即可獲得高純度的單個核細(xì)胞。

1.2.5 RT-qPCR檢測IL-β、NLRP3基因表達(dá) 將OD450值為0.2、0.6、1.0、1.4的淋球菌菌液與單個核細(xì)胞置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中共培養(yǎng)6 h，為感染組；設(shè)置不加淋球菌的空白對照組計OD450值為0。培養(yǎng)結(jié)束后，采用梯度離心去除淋球菌，收集單個核細(xì)胞。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SYBY Green核酸染料為熒光探針，用Real-time PCR檢測細(xì)胞IL-1β的表達(dá)。以GAPDH基因為內(nèi)參照，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)檢測熒光信號。每個樣品均設(shè)置3個復(fù)管，重復(fù)試驗三次。分別測定對照組和試驗組目的基因與內(nèi)參基因的Ct值，實驗結(jié)果取其均值，按照2-△△Ct相對定量公式計算實驗組相對于空白組的各基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，其中△△Ct=(實驗組目的基因平均Ct值-實驗組內(nèi)參基因平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct值-對照組內(nèi)參基因平均Ct值)。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 建立淋球菌OD450值(x)——菌落數(shù)(y)回歸方程 經(jīng)過計數(shù)培養(yǎng)基上菌落數(shù)目，選擇最佳稀釋倍數(shù)為106，計數(shù)此稀釋倍數(shù)下不同OD值菌液接種于固體培養(yǎng)上的菌落數(shù)，計算OD值與菌落數(shù)的回歸方程。見表2。

表2 淋球菌菌落平板計數(shù)

2.2 不同濃度淋球菌感染單個核細(xì)胞對IL-1β、NLRP3表達(dá)的影響 實時熒光定量PCR顯示，目的基因與內(nèi)參基因的熔解曲線峰均為單一峰且峰形銳利，未見其他峰值。擴(kuò)增曲線均光滑平穩(wěn)，熒光吸收圖譜的S形曲線圖形狀完整，符合定量檢測要求。相對定量分析顯示，將菌液OD450值為0的空白對照組IL-1β基因表達(dá)量設(shè)為1，則感染組IL-1β基因相對表達(dá)量隨淋球菌濃度升高出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，感染6 h菌液OD值為0.6的實驗組IL-1β基因相對表達(dá)量最高，而感染6 h菌液OD值為1.0的實驗組NLRP3基因相對表達(dá)量最高(圖1)。

3 討論

淋球菌LOS(脂寡糖)與DC(樹突狀細(xì)胞)的TLR4受體結(jié)合經(jīng)MAPKs、NF-кB、IRF3信號傳導(dǎo)通路激活固有免疫，誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNFα產(chǎn)生；接著DC啟動適應(yīng)性免疫分泌IL-23、前列腺素(PGE2)上調(diào)CD4+T趨化因子受體，促進(jìn)RORγt表達(dá)來使T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞；最終分泌大量IL-17A、IL-17F并引起中性粒細(xì)胞趨化至病灶吞噬淋球菌，促使活性氧(ROS)產(chǎn)生及iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)合成NO，誘導(dǎo)抗菌肽釋放，以清除淋球菌[1-4]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)雌二醇可下調(diào)淋球菌感染誘導(dǎo)的人HeLa中il-6、il-8、nlrp3 mRNA等趨化因子、促炎因子的表達(dá)起到抑制黏膜免疫及使單核細(xì)胞無法趨化至病灶來殺滅淋球菌，促進(jìn)其感染的作用[5]。因為不同濃度的淋球菌活菌刺激單核細(xì)胞可引起各種炎癥因子的表達(dá)出現(xiàn)各異，摸索合適的淋球菌定量感染條件不僅能使炎癥因子表達(dá)更穩(wěn)定，更有利于淋球菌對宿主感染免疫影響的研究，還有利于提高實驗的重復(fù)性。因此我們使用了不同濃度淋球菌體外感染單核細(xì)胞對IL-1β、NLRP3表達(dá)影響進(jìn)行了相關(guān)研究。

1a：感染6 h后IL-1βmRNA的表達(dá)；1b：感染6 h后NLRP3 mRNA的表達(dá)

圖1 PCR結(jié)果

淋球菌有黏附宿主黏膜的特性，感染人類泌尿生殖道主要表現(xiàn)為局部黏膜反應(yīng)，大部分為固有免疫反應(yīng)[2]。固有免疫包括4種模式識別受體，其中的NOD樣受體(NOD like receptor, NLRs)能識別淋球菌表面糖蛋白，激活下游分子進(jìn)而活化NF-κB和MAPK通路以及參與炎性小體的組成與活化誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-1、TNF等[6-8]。NLRP蛋白家族作為NLRs家族中最大的一個亞族，分布廣泛，典型代表NLRP3受到相應(yīng)刺激后，在胞內(nèi)組裝成炎性小體，通過街頭蛋白ASC募集促Caspase酶快速轉(zhuǎn)化為活性的蛋白酶，導(dǎo)致促炎因子IL-1釋放以及細(xì)胞死亡[9]。國外有研究證實淋球菌可通過組織蛋白酶B蛋白水解酶激活NLRP3炎癥復(fù)合物/ASC/Caspase-1軸來促進(jìn)IL-1β分泌[10]。與上述研究相一致的是本實驗通過檢測被不同濃度淋球菌感染的單個核細(xì)胞中IL-1β、NLRP3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)淋球菌感染單核細(xì)胞后均可導(dǎo)致IL-1β、NLRP3 mRNA表達(dá)增高，且在菌液OD450值分別為0.6、1.0刺激單個核細(xì)胞6小時后IL-1β、NLRP3基因相對表達(dá)量較高。表明本研究感染實驗成功，為日后淋球菌體外感染單個核細(xì)胞提供了重要的實驗參考數(shù)據(jù)。

雖然我們研究表明淋球菌感染可明顯上調(diào)NLRP3并促進(jìn)單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，但NLRP3是否是單核細(xì)胞抵抗淋球菌主要受體？Toll樣受體與NOD樣受體在淋球菌感染中何種受體起的作用大？上述問題仍有待進(jìn)一步研究。