馬天馳， 劉繼輝， 任伊賓， 盧 利， 楊 柯

1.沈陽(yáng)市口腔醫(yī)院 正畸科，遼寧 沈陽(yáng) 110001；2.中國(guó)科學(xué)院金屬研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔外科，遼寧 沈陽(yáng) 110053

修復(fù)由外傷、腫瘤、畸形修復(fù)等導(dǎo)致的骨組織缺損是臨床工作中面臨的巨大問(wèn)題[1]。常規(guī)修復(fù)分為自體移植修復(fù)和生物材料替代等，自體移植由于自體組織有限，移植操作難度大，手術(shù)費(fèi)用高，且增加新的創(chuàng)傷，患者精神、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較大[2-3]。隨著材料學(xué)發(fā)展，生物材料替代是近年來(lái)興起的一種修復(fù)方法。生物材料替代是利用金屬或非金屬材料替代缺失組織，這類材料需要有較高的生物相容性，以鈦、鈦合金較為常見(jiàn)。但鈦、鈦合金等價(jià)格高昂，加工不易，所以研發(fā)一種價(jià)格便宜、容易加工的材料是材料學(xué)的研究方向[4]。

傳統(tǒng)的不銹鋼合金含鎳，易致畸、致敏。研制一種機(jī)械性能良好且不含鎳的不銹鋼極為重要。無(wú)鎳不銹鋼用氮和鎂替代鎳，即高氮鋼，其擁有良好的抗腐蝕性、機(jī)械性能及生物相容性[5]。隨著氮含量的增加，高氮鋼的生物相容性增加。材料的親水性對(duì)細(xì)胞在其表面粘附和生長(zhǎng)起到關(guān)鍵作用。材料內(nèi)的氮元素含量影響材料的親水特性[6]。隨著氮含量增加，高氮鋼的生物相容性增加。冷變形的拉伸可改變材料表面親水性[7]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于機(jī)體內(nèi)，由于最早于骨髓中得到分離，常被稱為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞[8]。本研究利用大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞探討不同冷變形量的高氮不銹鋼的生物相容性差異?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)材料為中國(guó)科學(xué)院金屬研究所提供的不同冷變形量的高氮不銹鋼，拉伸率分別為0、14%、34%、64%,分別設(shè)為A、B、C、D組。經(jīng)高溫固溶、切片、拋光，制作成10 mm×10 mm×1 mm的薄片，清洗消毒后備用。

1.2 研究方法

1.2.1 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)擴(kuò)增 將4周齡的SD大鼠(雌雄不限)脫頸處死后，無(wú)菌分離雙側(cè)股骨，去除軟組織，剪斷骨端，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10 ml沖洗骨髓腔。收集沖洗后液體，置于培養(yǎng)瓶中，2 d后首次換液，連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，每隔4 d換液，每7 d傳代。培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+雙抗；培養(yǎng)條件37℃，濕度100%，5% CO2。傳代比例為1∶6。連續(xù)擴(kuò)增細(xì)胞備用。

1.2.2 高氮鋼表面細(xì)胞培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo) 將預(yù)先消毒處理好的不同冷變形比例的高氮鋼片放入24孔板，每種冷變形比例的高氮鋼片設(shè)3個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為1×104個(gè)/ml，以模仿人體的成骨微環(huán)境。在每個(gè)材料表面及空白孔內(nèi)滴加1 ml細(xì)胞懸液。培養(yǎng)基:DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+雙抗。培養(yǎng)條件：37℃，濕度100%,5% CO2。連續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞粘附 將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞接種于不同冷變形比例的高氮鋼片表面，12 h后輕輕去掉培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)。將粘附細(xì)胞量除以種植細(xì)胞量以獲得細(xì)胞在不同金屬片表面的粘附率。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn) 稱取0.5 g MTT，溶于100 ml的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，針頭濾器過(guò)濾除菌，置于4℃ 避光保存。在配制和保存的過(guò)程中，容器用鋁箔紙包住。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)不同冷變形高氮鋼表面粘附細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)，由于一部分粘附于金屬材料表面的細(xì)胞已死亡，為精確確定金屬表面活細(xì)胞的數(shù)目和細(xì)胞活力而進(jìn)行MTT細(xì)胞活性檢測(cè)。將在金屬表面培養(yǎng)的第1、3、5 d的細(xì)胞按試劑盒的方法進(jìn)行MTT檢測(cè)。

1.2.5 觀察材料表面細(xì)胞形態(tài) 在金屬片接種細(xì)胞的第1、3、5天分別按組取出金屬片，PBS沖洗，2.5%戊二醛固定，50%、75%、95%、100%乙醇梯度脫水，金相顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)。

1.2.6 堿性磷酸酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 分別將種植于材料表面的細(xì)胞培養(yǎng)至第1、3、5天，取出用PBS輕輕沖洗3遍，在4℃環(huán)境下用0.01% TritonX-100裂解細(xì)胞12 h，然后用吸管反復(fù)吹打1 min，使細(xì)胞充分碎解。按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，堿性磷酸酶活性以每克蛋白中含有的金氏單位表示，結(jié)果以3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料表面細(xì)胞粘附率及細(xì)胞形態(tài) A、B、C、D組高氮不銹鋼表面細(xì)胞粘附率分別為88%、90%、93%、94%。隨著冷變形率的提升，材料表面粘附的細(xì)胞數(shù)量提升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。將基質(zhì)干細(xì)胞種植于材料表面培養(yǎng)1、3、5 d后，在金相顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞在材料表面生長(zhǎng)良好并發(fā)生增殖。見(jiàn)圖1～4。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 比較第1天各組金屬表面的細(xì)胞光密度值，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第3、5天，隨不同冷變形率高氮鋼與細(xì)胞接觸作用時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度逐漸增大，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，各種冷變形率的高氮鋼均對(duì)基質(zhì)干細(xì)胞沒(méi)有破壞和抑制生長(zhǎng)作用,組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 金相顯微鏡下拉伸率為0的高氮鋼表面骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)情況(200倍，a.第1天；b.第3天；c.第5天)圖2 金相顯微鏡下拉伸率為14%的高氮鋼表面骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)情況(200倍，a.第1天；b.第3天；c.第5天)圖3 金相顯微鏡下拉伸率為34%的高氮鋼表面骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)情況(200倍，a.第1天；b.第3天；c.第5天)

圖4 金相顯微鏡下拉伸率為64%的高氮鋼表面骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)情況(200倍，a.第1天；b.第3天；c.第5天)

表1 不同冷變形率的高氮鋼MTT檢測(cè)光密度值比較

注：與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05；與C組比較，③P<0.05

2.3 堿性磷酸酶活性檢測(cè) 第1天，4種金屬表面的細(xì)胞堿性磷酸酶活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在第3、5天時(shí)，隨著冷變形率的增高，高氮鋼表面的細(xì)胞堿性磷酸酶活性增高，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同冷變形率的高氮鋼表面細(xì)胞堿性磷酸酶活性比較/U·g-1

注：與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05；與C組比較，③P<0.05

3 討論

各種原因引起的骨缺損是臨床常見(jiàn)的癥狀，由于骨缺損而引起的軟組織塌陷和相關(guān)功能障礙是臨床中的常見(jiàn)問(wèn)題[9]。生物醫(yī)用金屬材料由于高硬度的力學(xué)性能及耐腐蝕性被廣泛應(yīng)用，以鈦、鈦合金及醫(yī)用奧氏體不銹鋼較為常見(jiàn)。奧氏體不銹鋼含有鎳，鎳原子對(duì)細(xì)胞的直接損害及長(zhǎng)期致畸作用已被證實(shí)。性能良好且不含鎳的生物醫(yī)用金屬材料對(duì)骨缺損患者極為重要[10]。

生物醫(yī)用金屬材料植入骨組織的過(guò)程中，不可避免的會(huì)造成骨組織損傷[11]。早期機(jī)械性固位時(shí)，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在骨修復(fù)開(kāi)始時(shí)會(huì)從組織中游出，并向損傷處聚集，在各種生物因子的作用下，產(chǎn)生成骨性分化，首先分化為成骨前體細(xì)胞，最終變?yōu)楣羌?xì)胞[12]。骨基質(zhì)將植入材料和骨組織結(jié)合，最終完成生物性固位。在此過(guò)程中，處于正常骨組織和植入材料之間的基質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量、活性、增殖性及成骨分化能力對(duì)于植入材料的后期穩(wěn)定性和生物相容性起著重要作用[13]。本研究中，基質(zhì)干細(xì)胞作為檢測(cè)不同冷變形量的高氮鋼的生物相容性的種子細(xì)胞，將其接種于不同冷變形量的高氮鋼表面12 h后發(fā)現(xiàn)，隨著冷變形量的增加，其細(xì)胞粘附率同時(shí)增加，這可能于冷變形量增大提高材料表面的親水性有關(guān)。作為生物材料此結(jié)果意味著在材料植入機(jī)體后，初期冷變形量大的高氮鋼周圍可以聚集更多的基質(zhì)干細(xì)胞。MTT檢測(cè)法可有效區(qū)分細(xì)胞群中的活性細(xì)胞[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，隨著冷變形量的增加，高氮鋼表面的細(xì)胞活性隨之增加。堿性磷酸酶活性可檢測(cè)基質(zhì)干細(xì)胞在材料表面的成骨能力，其結(jié)論為隨著冷變形量的增加，高氮鋼表面的細(xì)胞堿性磷酸酶活性隨之增加[15]。同時(shí)，通過(guò)金相顯微鏡直觀觀察整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中高冷變形量的高氮鋼表面的細(xì)胞密度更高。

綜上所述，隨著冷變形率的提高，高氮鋼的生物相容性提高。但加工冷變形會(huì)對(duì)高氮鋼的力學(xué)性能產(chǎn)生影響，而植入材料不僅要具有良好的生物相容性，還需具有良好的機(jī)械性，今后仍需進(jìn)一步研究。