鄧謝淑婷 劉興隆 周璇 袁竹 孫滋蔚 吳海燕

(1. 四川大學華西臨床醫(yī)學院；2. 四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院藥理教研室，四川 成都 610041)

1 肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，Spn)的分類及其感染

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，Spn)是一種有莢膜的革蘭陽性雙球菌，可按莢膜多糖組成成分的不同對其進行血清型分型。截止至2013年，世界范圍內已出現(xiàn)90多種不同的血清型，且其分布具有很強的地域性和時間性[1]。

肺炎鏈球菌感染可引起中耳炎、鼻竇炎等呼吸道粘膜疾病，若細菌入血可能會引起更嚴重的侵襲性肺炎球菌疾病(Invasive pneumococcal diseases，IPD)[2]，在發(fā)展中國家，每年大約有1450萬嬰兒患有嚴重的肺炎球菌疾病，并在全球范圍內造成了100多萬人的死亡[3]。根據(jù)其感染的機制，人們不斷地開發(fā)出得以應對的治療方法。例如，肺炎鏈球菌在鼻咽部定植之前需與此處的常駐微生物群競爭從而取得繁殖優(yōu)勢。有研究顯示，細胞因子白介素-17(IL-17)可以預防肺炎鏈球菌鼻腔定植的發(fā)生[4]，其抵抗肺炎鏈球菌定植的機制可能是由于它所驅動的鼻腔微生物群組成的變化[5]，且它的保護作用依賴于細菌侵襲力和莢膜厚度：對于高侵襲性薄莢膜的肺炎鏈球菌，IL-17具有更強的保護作用[6]?？傊S著更多研究的開展，肺炎鏈球菌感染機制的研究得以不斷深入，為疾病的預防與治療提供了新思路。

2 傳統(tǒng)多糖疫苗

莢膜多糖疫苗是目前預防肺炎鏈球菌感染最主要應用的疫苗，并且兒童和成人所接種的多糖疫苗種類不同，應用于兒童的主要是7，10和13價肺炎球菌結合疫苗(PCV-7，-10，-13)，而應用于成人的是23價肺炎球菌純多糖疫苗(PPV-23)。但隨著大面積的投入使用，多糖疫苗顯示出了一定的局限性。除了其生產的高成本，無法誘導二次免疫應答，有限的血清型覆蓋率[7]等原因之外，近期有地區(qū)監(jiān)測研究顯示，在引入PCV-13國家免疫計劃后，非疫苗血清型(Non-vaccinetypes，NVT)與其所致的侵襲性肺炎球菌疾病(IPD)比例有所增高[8]，這對多糖疫苗的保護作用提出了更大的考驗?？傊覀冃枰獙ふ倚碌囊呙?，以便能對更廣泛的肺炎鏈球菌菌株提供更經濟的防護。

3 新型疫苗的開發(fā)

新型肺炎鏈球菌疫苗的研發(fā)需要考慮合適的疫苗抗原、佐劑和遞送載體。目前處于研究階段的新型疫苗抗原候選物主要為以下三種：蛋白質疫苗、全細胞疫苗和DNA疫苗。

3.1 蛋白質疫苗

由于在不同血清型菌種間較保守的結構組成，蛋白質抗原在肺炎鏈球菌疫苗中的應用是人們在新疫苗開發(fā)中重要的突破口。目前此種疫苗在研究中取得了較大進展，在此我們主要討論以下三種：肺炎球菌溶血素(Pneumolysin，Ply)、肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface proteinA，PspA)和肺炎球菌表面蛋白C(Pneumococcal surface protein C，PspC)。

3.1.1肺炎球菌溶血素

由于肺炎球菌溶血素(Pneumolysin，Ply)具有細胞毒性，不能以原型直接作為疫苗組成成分，需對其結構中的某些氨基酸位點進行修飾，從而產生低毒性的衍生物，方可加入到疫苗中。變異的溶血素衍生物雖然毒性降低，但仍保留了原溶血素的免疫原性與免疫反應性。最近，一項研究測定了一種溶血素衍生物在小鼠體內免疫反應的T細胞表位(如表1)，并發(fā)現(xiàn)其與通過計算機預測出來的該衍生物在人體中的T細胞表位具有相當大的重疊。如果小鼠中鑒定出的T細胞表位也可以在人體中得到證實，這些表位中具有一定序列的氨基酸將可作為新型疫苗的重要組成成分。

表1 溶血素衍生物PlyD1中的T細胞表位[9]

注：劃線部分為免疫優(yōu)勢T細胞表位，即引起最強的T細胞反應；其余為亞優(yōu)勢T細胞表位。

3.1.2肺炎球菌表面蛋白A

肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface proteinA，PspA)是一種膽堿結合表面蛋白，其干擾補體成分C3在肺炎球菌細胞表面的固定，從而抑制補體介導的細胞毒作用，以促進細菌的免疫逃避。在小鼠實驗中，PspA顯示出對肺炎鏈球菌所致的膿毒癥、肺炎的保護作用[10]。值得注意的是，PspA的N-末端區(qū)域由重復的α端螺旋結構組成，其長度和氨基酸序列可變，雖然針對此區(qū)域的抗體具有一定的交叉保護性，但當疫苗所包含的PspA和攻擊菌株的PspA具有相同的α螺旋結構時，疫苗體現(xiàn)出最強的保護作用[11]，因此我們可以在疫苗開發(fā)中加入一種以上的PspA，以增強疫苗的覆蓋率。

3.1.3肺炎球菌表面蛋白C

肺炎球菌表面蛋白C(Pneumococcal surface protein C，PspC)可促進肺炎鏈球菌對鼻咽部上皮細胞的粘附，它的結構中具有和PspA相似的PR區(qū)域，即蛋白質N-末端和C-末端之間的一段富含脯氨酸的保守氨基酸序列，故針對PspC的抗體可以同時顯示出對PspA的交叉保護作用[12]。

值得注意的是，肺炎鏈球菌在正常情況下為鼻腔部的微生物共生體，完全消除定植于鼻腔部的全部肺炎鏈球菌是難以實現(xiàn)甚至是有害的，因此確定肺炎鏈球菌由正常共生體轉化為致病菌的定植量的界值是研究人員目前面對的挑戰(zhàn)；另外，肺炎鏈球菌與其他上呼吸道細菌和病毒以及共生菌群之間具有協(xié)同或拮抗相互作用[13]。例如，一些上呼吸道細菌和病毒的感染是使肺炎鏈球菌轉化為病原體的潛在因素，目前已有研究證明了流感病毒和肺炎鏈球菌 之間的協(xié)同作用[14]，因此對于一些沒有針對甲型流感常規(guī)免疫計劃的國家，其鼻咽部的微生物負擔增加，可能會影響疫苗的效力；另一方面，肺炎鏈球菌與鼻腔部中某些菌種之間具有拮抗關系。有研究顯示，肺炎鏈球菌定植的減少會導致人體內金黃色葡萄球菌攜帶率的增加[15]，因此在引入肺炎鏈球菌蛋白疫苗前，我們需要考慮肺炎鏈球菌和與其具有拮抗關系菌種之間的平衡變化。此外，有研究顯示，在一些具有高肺炎鏈球菌細菌負荷的國家，疫苗可能難以體現(xiàn)出預期的保護作用，原因可能是長期的高濃度抗原環(huán)境導致的CD4+T細胞功能的部分喪失進而影響B(tài)細胞分化成抗體分泌細胞的過程[16]。因此，在未來蛋白質疫苗的開發(fā)與推廣過程中，我們需要考慮不同地區(qū)的免疫應答因素。

3.2 全細胞疫苗

全細胞疫苗(Whole cell vaccine，WCV)也是有力的新疫苗開發(fā)候選物[17]。將減毒或滅活的肺炎鏈球菌菌體整個注入到宿主體內，為免疫協(xié)同應答提供了多個作用靶點，并且其生產的低成本也為在發(fā)展中國家的推廣創(chuàng)造了條件。目前批準應用的全細胞疫苗主要為鋁佐劑肺炎球菌疫苗，其抗原為莢膜陰性的減毒肺炎球菌突變體，并通過加入氫氧化鋁以增強其免疫反應。對于此種疫苗，推薦使用注射給藥。目前美國正在進行全細胞疫苗臨床試驗的第一階段研究以探究其安全性與免疫原性。但是全細胞疫苗目前仍存在很多隱慮。首先，處理后的肺炎球菌所提供的抗原位點并不是均對免疫防御具有正性協(xié)同作用，有些特定組合的抗原可能會干擾疫苗的保護作用；其次，減毒菌株在體內逆轉為致病狀態(tài)的可能性仍令人擔憂；此外，由于疫苗的保護效力受到滅活方法、給藥途徑和免疫途徑等多因素的影響，因此我們仍然需要進行更多的研究去探索其最佳的制造與應用方法。

3.3 DNA疫苗

DNA疫苗目前仍處于研究探索階段。一項研究顯示，將編碼攻擊菌株表面蛋白A的DNA序列注射至小鼠體內，其誘導的保護作用的水平與直接注射純化蛋白質所誘導的相似[18]，這為DNA抗原在疫苗開發(fā)中的應用提供了實驗依據(jù)。DNA疫苗易于制造、成本低、運輸穩(wěn)定，這些特性使其成為在發(fā)展中國家推廣的理想選擇。但裸露的質粒DNA僅誘導較弱的免疫應答，這可能與其在粘膜表面的降解有關。因此為了構建有效的DNA疫苗，我們需要選擇合適的DNA遞送系統(tǒng)。有研究顯示，殼聚糖作為天然可生物降解的多糖可與DNA分子絡合形成納米粒子，從而提高疫苗遞送的能力，增強其所誘發(fā)的免疫應答反應[19]，這為日后DNA疫苗的開發(fā)在遞送系統(tǒng)的選擇上提供了啟示。

3.4 疫苗的其他組成成分

除了疫苗抗原外，佐劑也是疫苗中重要的組成成分，它是能夠改變或增強機體對抗原的特異性免疫應答、發(fā)揮輔助作用的一類物質。選擇合適的佐劑是新疫苗開發(fā)成功的關鍵。如將全細胞疫苗以鼻內用藥方式作用于粘膜免疫時可以加入霍亂弧菌作為佐劑以增強其減少細菌鼻咽定植的保護作用。其增強粘膜免疫的機制可能與上呼吸道抗肺炎球菌粘膜分泌型IgA抗體的產生增加有關[20]。

此外，新疫苗的開發(fā)還需要選擇合適的載體。例如，乳酸菌是我們生活中常用的一種細菌，有研究顯示，將可產生肺炎球菌毒力蛋白的重組乳酸菌注入到小鼠體內時，可誘導血清中相關抗體的生成，并且作為益生菌，其對人體的健康傷害較小，體現(xiàn)了它作為疫苗遞送載體的巨大潛力[21]。

綜上所述，雖然目前針對新疫苗的開發(fā)仍然存在許多未解決的問題，但是不可否認的是，新的疫苗的出現(xiàn)是符合當今疫苗使用趨勢的。有研究顯示，對于未接種人群，不同血清型的肺炎鏈球菌所致疾病的發(fā)病率都遵循的幾乎相同的年齡變化分布曲線(見圖1)，說明機體針對肺炎鏈球菌的免疫并不是血清依賴性的，可能存在一種共同的機制將各種血清型作為一個整體進行免疫防御，這為開發(fā)非血清依賴性的新疫苗提供生理學依據(jù)。

圖1 不同莢膜血清型引起的侵襲性肺炎球菌疾病的年齡特異性發(fā)病率[22]

在“超級細菌”勢頭迅猛的今天，肺炎鏈球菌對常規(guī)疫苗敏感性的下降令人擔憂。我們不得不在已有的預防方法基礎上探索新的便于生產、更為高效的疫苗。幸運的是，聚合酶鏈式反應和高通量全基因組測序等多種新興測序技術的發(fā)展為我們在分子水平上認識和應對肺炎鏈球菌提供了巨大幫助。

蛋白質疫苗、全細胞疫苗和DNA疫苗在全新的方向上為新型疫苗的研制提供了選擇。蛋白質疫苗是最早進入我們視野的新型疫苗候選物，將其與多糖綴合從而研發(fā)出的肺炎球菌結合疫苗是市場上應用最廣的肺炎鏈球菌疫苗。目前研發(fā)蛋白質候選疫苗最普遍和最全面的方法之一是在疾病自然感染階段的人血清中篩選具有強烈反應性的抗原。此種方法已經為我們確定了多種肺炎鏈球菌蛋白疫苗候選物，目前圍繞這些候選物的相關研究正在積極開展。生產全細胞疫苗的技術要求程度低且成本不高，為其在發(fā)展中國家的推廣創(chuàng)造了條件。然而以全細胞作為疫苗的抗原仍然存在許多問題，如抗原之間的干擾作用，細胞在體內的逆轉可能性等，另外，尋找合適的佐劑和滅活方法也是全細胞疫苗在應用和推廣過程中的挑戰(zhàn)。DNA疫苗仍處在研究探索階段，目前還未有較多的文獻記載其在人體臨床試驗中的相關成果，但不可否認的是，此研究方向存在巨大的潛力。