祝飛美 何瑾晨 黃寧 王祎

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，四川 成都 610041)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是一類易引起多種急慢性感染的革蘭陰性機(jī)會(huì)致病菌，該菌分泌的綠膿菌素(Pyocyanin，PCN)是一種具有氧化還原活性的吩嗪類物質(zhì)，可自由穿透生物膜[1]，通過(guò)產(chǎn)生活性氧(Reactive oxidant species, ROS)消耗細(xì)胞內(nèi)還原性GSH并通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)抗氧化信號(hào)通路的活化引起廣泛的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步引起細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致包括中性粒細(xì)胞[2]、肺上皮細(xì)胞[3]等多種細(xì)胞死亡。巨噬細(xì)胞在PA感染引起的一線免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用[4]，但目前關(guān)于PCN對(duì)巨噬細(xì)胞的損傷作用及機(jī)制知之甚少，因此，深入探討PCN介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷的具體機(jī)制，對(duì)于研究新型的免疫輔助藥物和解毒藥物對(duì)抗銅綠假單胞菌感染治療具有重要意義。

瞬時(shí)受體電位2(Transient receptor potential melastain 2，TRPM2)通道廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞表面，能被二磷酸腺苷核糖以及H2O2刺激產(chǎn)生的活性氧自由基ROS激活而開(kāi)放，介導(dǎo)Ca2+離子內(nèi)流入單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，從而進(jìn)一步引起細(xì)胞死亡[5]。PJ34是DNA修復(fù)蛋白(poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)的抑制劑，可以有效阻斷活性氧自由基ROS引起的細(xì)胞膜上TRPM2通道[6]。本文擬選用小鼠腹腔來(lái)源巨噬細(xì)胞RAW264.7作為細(xì)胞感染模型，探討TRPM2離子通道抑制劑PJ34在PCN引起的氧化應(yīng)激損傷中的作用，為綠膿菌素感染的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞

MTT (Beyotime公司)；胎牛血清(Hyaline公司)；DMEM(Gebico公司)；RAW264.7細(xì)胞均購(gòu)自上海中科院細(xì)胞中心，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按4×104個(gè)細(xì)胞·孔-1接種于96孔板，過(guò)夜培養(yǎng)后更換含不同濃度PJ34(0，100，200，400，800，1600 nM)或者含不同濃度PCN(0，12.5，25，50，100 μ)的新鮮培養(yǎng)基100 μL。處理24 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，于37℃、5%CO2孵箱中避光孵育2 h，棄去孔中培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶解底部藍(lán)色結(jié)晶，搖床避光震蕩10 min后上機(jī)，于595nm處檢測(cè)吸光度，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

1.2.2熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平

RAW264.7細(xì)胞按照每孔16×104個(gè)·孔-1接種于24孔板，過(guò)夜后800 nM PJ34預(yù)處理2 h(對(duì)照組給與0.1% DMSO))加入100 μ的PCN孵育3 h后，PBS洗3次，更換新鮮培養(yǎng)基，加DHE10 μ每孔37 ℃孵育20 min，OLYMPUS倒置熒光顯微鏡IX73(Ex/Em=518 nm/605 nm)觀察。另收集細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DHE熒光強(qiáng)度。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平

取激光共聚焦培養(yǎng)皿，按照每皿1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種。過(guò)夜后800 nM PJ34預(yù)處理2 h(對(duì)照組給與0.1%DMSO)，加入 100 μ的PCN孵育3 h，HBSS緩沖液洗3次，后每孔加Rhod-/AM(5 μ)，37 ℃孵育30 min，激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LMS 710)下觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞吞噬功能

RAW264.7細(xì)胞按照每孔16×104個(gè)·孔-1接種于24孔板，過(guò)夜后800 nM PJ34預(yù)處理2 h(對(duì)照組給與0.1% DMSO)，加入100 μ的PCN孵育3 h后，加入18 μg·mL-1碳顆粒繼續(xù)共孵育2 h，顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞吞噬碳顆粒的情況。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果如圖1A所示，當(dāng)采用PJ34(0，100，200，400，800，1600 nM)處理RAW264.7細(xì)胞24 h，對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響。但PCN(25，50，100 μ)顯著降低RAW264.7細(xì)胞存活率，并呈一定的濃度依賴趨勢(shì)，如圖1B所示。在PCN 100 μM處理24 h的條件下，與空白組相比較，細(xì)胞的存活率僅有31%-35%，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。并且與單用PCN 100 μM組相比較，PJ34預(yù)處理組的細(xì)胞存活率明顯較高(P<0.01)。

2.2 PCN對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+水平的影響及PJ34的作用

熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，結(jié)果如圖2A所示，PCN未處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平較低，PCN(100 μM)刺激3 h，PJ34未預(yù)處理組與預(yù)處理組比較，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯較高。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖2C，800nM的PJ34預(yù)處理可有效緩解PCN刺激引起的細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高(P<0.05)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平與Ca2+水平密切相關(guān)，PCN能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體膜的通透性增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生進(jìn)一步的氧化應(yīng)激損傷[7]。激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平結(jié)果如圖2B所示，PCN刺激下，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加伴隨著細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高，而PJ34可有效抑制PCN引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加。

圖1 PJ34 和PCN 對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響注：A：不同濃度PJ34對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響；B：不同濃度PCN對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響；C：PJ34對(duì)PCN誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞存活率的影響。n=6，與未用PJ34 預(yù)處理組比較，*P﹤0.05；**P﹤0.01；***P<0.001。

圖2 PJ34對(duì)PCN引起的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+水平的影響注：A和C：PJ34對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響；B：PJ34對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響。與單用PCN組比較，*P﹤0.05。

2.3 PJ34緩解PCN引起的巨噬細(xì)胞吞噬功能損傷

巨噬細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，其主要功能之一是清除吞噬病原體或外來(lái)物質(zhì)。為了研究PCN及PJ34對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，我們采用PBS制備合適濃度的碳粒，經(jīng)超聲處理，得到18 μg·mL-1的碳顆?；鞈乙?，在各處理組條件下加入18 μg·mL-1碳顆?；鞈乙号c細(xì)胞共孵育，顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞吞噬碳粒的情況。如圖3A所示，在PCN未處理組，巨噬細(xì)胞對(duì)碳顆粒的吞噬能力較強(qiáng)，當(dāng)給與100 μ的PCN處理3 h后，巨噬細(xì)胞幾乎喪失吞噬碳顆粒的能力，而PJ34預(yù)處理則可提高由PCN引起的RAW264.7細(xì)胞吞噬功能損傷(P<0.05)。各處理?xiàng)l件下巨噬細(xì)胞吞噬碳粒的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如圖3B所示。

圖3 PCN及PJ34對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬功能的影響A：顯微鏡下觀察各處理組細(xì)胞吞噬碳粒的能力；B：Image J統(tǒng)計(jì)分析各處理組細(xì)胞吞噬碳粒的水平。與PCM-100 μm相比，*P<0.05；**P<0.01。n=3。

3 討論

在現(xiàn)階段世界范圍內(nèi)廣泛爆發(fā)的多重耐藥銅綠假單胞菌感染以及治療策略嚴(yán)重缺乏的嚴(yán)峻形勢(shì)下，研發(fā)新的補(bǔ)充治療策略迫在眉睫。而目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于PA感染以及PCN感染的研究多集中在肺泡上皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，關(guān)于PCN對(duì)單核巨噬細(xì)胞的研究報(bào)道較少。同時(shí)越來(lái)越多的研究表明，廣泛分布于免疫細(xì)胞表面的TRPM2離子通道在炎癥小體的活化，ROS的產(chǎn)生以及肺部炎癥和疼痛等過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用[8]。這些研究結(jié)果強(qiáng)烈提示研究TRPM2離子通道在免疫細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制對(duì)于多種疾病意義重大。因此在本研究中我們提出假設(shè)，TRPM2通道的活化是PCN介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷的重要機(jī)制。

PARP是廣泛表達(dá)于真核細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)蛋白，PARP的表達(dá)活化是氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞內(nèi)NAD+增高，TRPM2通道開(kāi)放及TRPM2通道依賴的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的必要條件[9]。在PARP-1敲除細(xì)胞中，氧化應(yīng)激刺激不能引起細(xì)胞的TRPM2通道開(kāi)放[10,11]。在本研究中，我們采用PARP抑制劑PJ34預(yù)處理細(xì)胞，抑制巨噬細(xì)胞表面TRPM2通道的開(kāi)放，觀察其對(duì)PCN引起的細(xì)胞損傷的作用。我們的研究結(jié)果顯示銅綠假單胞菌分泌的毒力因子綠膿菌素能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的ROS水平和Ca2+水平升高，并導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的吞噬功能損傷，最終引起巨噬細(xì)胞死亡。而當(dāng)給與PJ34預(yù)處理后，PCN對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性損傷作用得到有效緩解，PCN引起的ROS水平和Ca2+水平增高得到抑制，對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的損傷作用減弱，并提高了PCN刺激下巨噬細(xì)胞的存活率。

本研究結(jié)果提示細(xì)胞膜TRPM2離子通道在免疫細(xì)胞抵抗外來(lái)應(yīng)激時(shí)發(fā)揮的重要作用,可以明確的是本研究通過(guò)PARP抑制劑PJ34阻斷TRPM2離子通道的活化，抑制由于該離子通道活化引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平失衡，可以有效緩解PCN感染條件下的巨噬細(xì)胞死亡，維持PCN狀態(tài)下巨噬細(xì)胞的吞噬功能，保護(hù)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，為綠膿菌素感染的治療提供了新的思路，也為T(mén)RPM2離子通道在氧化應(yīng)激疾病發(fā)病中的作用提供有力證據(jù)。