戴 一，曹殿潔

1安徽新華學院藥學院，合肥 230088；2中國科學技術(shù)大學化學系，合肥 230036

白藜蘆醇為一多羥基茋類化合物，存在于多種植物中如葡萄、花生及中藥虎杖等[1]。白藜蘆醇具有多種藥理活性如心臟保護[2]、神經(jīng)保護[3,4]及抗抑郁作用[5]等。近年來，白藜蘆醇作為抗癌成分引起了廣泛地關(guān)注。白藜蘆醇通過作用多靶點如P53、Bax/Bcl-2、Caspase-9、、PARP、Cyclins、cdks、MAPK、 PI3K/AKT、JAK、NF-κB、AP-1、MMP-2、VEGF等抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡及阻滯腫瘤轉(zhuǎn)移等[6,7]。一氧化氮(NO)是一氣體信使分子，生物活性多樣[8]，高劑量NO(微摩爾濃度)可以抑制腫瘤生長[9]及逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性[10].鑒于NO為活潑性氣體且不易操作，因此NO的使用多為一些能在體內(nèi)產(chǎn)生NO的化合物即NO供體，呋咱氮氧化物即是一類NO供體，且對酸堿比較穩(wěn)定，在體內(nèi)巰基化合物的作用下釋放出NO。多藥聯(lián)合是抗腫瘤的有效方法[11]。本實驗設(shè)計合成了白藜蘆醇與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物，并進一步采用MTT法評價了設(shè)計化合物的抗腫瘤活性，為白藜蘆醇與NO供體的一體化研究開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BruckerACF-300型核磁共振儀(美國布魯克科技有限公司)，API3000質(zhì)譜儀(美國PE公司)，bio-rad mode 680酶標儀(美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司)，白藜蘆醇(純度大約98%)即化合物1，購與大連美侖生物技術(shù)有限公司。DEME培養(yǎng)基購于hyclone公司，胎牛血清FBS購于lonsera公司，MTT 購置于碧云天公司，其他試劑均為分析純。

1.2 受試細胞株

人肝癌HepG2細胞、人乳腺癌MCF-7細胞及人肺癌A549細胞來自于ATCC(美國)。

圖1 白藜蘆醇(化合物1) 結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of resveratrol(compound 1)

1.3 結(jié)構(gòu)修飾路線

以肉桂醇為底物，首先合成呋咱氮氧化物2，再與丁二酸酐反應(yīng)引入羧基制得化合物3，化合物3在EDCI，DMAP條件下與白藜蘆醇酚羥基成酯制備出白藜蘆醇與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物(化合物4)，見圖2。產(chǎn)物經(jīng)NMR、MS確認結(jié)構(gòu)。

圖2 白藜蘆醇呋咱氮氧化物偶聯(lián)物合成路線圖Fig.2 The synthesis of conjugente of resveratrol and furoxans.

1.4 化學合成

1.4.1 化合物2的合成[12]

取肉桂醇(5.37 g，40 mmol)溶于8 mL冰乙酸中，往其中滴加120 mmol NaNO2飽和水溶液10 mL，溫度不超過70 ℃，滴加完畢，室溫繼續(xù)攪拌1 h，加水100 mL，用乙醚萃取3次，乙醚層合并，用飽和食鹽水洗滌3次，無水硫酸鈉干燥，過濾，硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(4∶1)洗脫，得淺黃色固體產(chǎn)物，收率為67%。

1.4.2 化合物3的合成

取化合物2(384 mg,2 mmol)溶于20 mL二氯甲烷中，加丁二酸酐(300 mg,3 mmol)，DMAP(22.9 mg,0.2 mmol)，室溫反應(yīng)，TLC跟蹤，反應(yīng)完畢，稀鹽酸洗滌，冰水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮至干，得灰白色固體，收率為86%。

1.4.3 化合物4的合成

取白藜蘆醇(228 mg,1 mmol),化合物3(1.168 g,4 mmol)，EDCI(1.712 g,9 mmol)，DMAP(741 mg,6 mmol)溶于20mL丙酮中，室溫攪拌反應(yīng)，TLC跟蹤，反應(yīng)完畢，減壓旋蒸除去溶劑，以乙酸乙酯溶解，分別以稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉溶液及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，TLC分析(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=1∶1，主斑點Rf=0.3)，過濾，粗產(chǎn)物過硅膠柱，以石油醚∶乙酸乙酯=2∶1洗脫，得白色固體，收率為64%。

1.5 白藜蘆醇與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物體外NO釋放[13]

1.5.1 NO 標準曲線繪制

取96孔板，各孔中分別加入稀釋好的不同濃度NaNO2標準溶液(250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91 μM) 50 μL，復(fù)孔3個，再分別加入Griess試劑(含1.0%磺胺、5.0%磷酸、0.1% N-1-萘乙二胺鹽酸鹽水溶液)孵育10 min后于540 nm測定吸光度，繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.5.2 白藜蘆醇與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物體外NO釋放

化合物2、3、4分別溶于PBS(50 mM,pH7.4)/DMSO (1∶1)混合溶液均制成500 μM濃度，加入L-半胱氨酸 (5 mM) 溶液后于37 °C 避光孵育24 h。取樣點樣品按照1.5.1法置96孔板后加入Griess試劑(含1.0%磺胺、5.0%磷酸、0.1% N-1-萘乙二胺鹽酸鹽水溶液)孵育10 min后于540 nm測定吸光度，計算24 h NO的釋放濃度。

1.6 白藜蘆醇與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物抗腫瘤活性研究

取對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)于96孔板中，每孔加培養(yǎng)基100 μL(約含3 000個細胞)，于37 ℃，5% CO2的全濕條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h后給不同濃度的待測化合物，平行3個孔，陰性對照組加給藥組等體積的培養(yǎng)基，以DEME 培養(yǎng)基作為空白對照組，給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加5 mg/mL的MTT溶液20 uL,繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 uL,震蕩10 min，酶標儀570 nm測定吸光度OD值，計算抑制率及IC50值。

抑制率(%)=[1-(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物表征

化合物2淺黃色固體，TLC分析Rf約0.6(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1)；1H NMR (300 MHz,Chloroform-d) δ 7.91～7.79 (m,2H),7.66～7.50 (m,3H),4.77 (s,2H)，2.64 (brs,1H),與文獻一致[11]。

化合物3為白色固體，TLC分析Rf約0.2(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1)；1H NMR (300 MHz,Chloroform-d) δ 7.79～7.66 (m,2H),7.67～7.47 (m,3H),5.19 (s,2H),2.77～2.60 (m,4H)，與化合物2比較分析，結(jié)構(gòu)正確。

化合物4白色固體，TLC分析Rf約0.3(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=1∶1)；mp.119～121 ℃；UV (MeOH)λmax (logε) 231 (4.06),274 (3.78),299 (3.80),311 (3.79) nm；IR (KBr)νmax3010,2821,1751,1684,1523,1495,1397,1335,1187,1050,913,868,790,659 cm-1;1H NMR (300 MHz,Acetone-d6) δ 7.97-7.87 (6H,m,Ph-H(6),7.79～7.60 (11H,m,Ph-H(9,H-2,6),7.46～7.17 (6H,m,H-3,5,8,10,12,14),6.93 (1H,d,H-7),5.38 (6H,s,O-CH2-),3.08～2.95 (6H,m,-CH2-CH2-),2.94～2.83 (6H,m,-CH2-CH2-)；13C NMR (100 MHz,Acetone-d6) δ 171.4 (CO),170.4 (CO),157.3 (C=N-O),151.6 (C-11,13),150.8 (C-4),139.7 (C-9),134.6 (C-1),131.3 (Ph-C) ,129.7 (C-2,6),129.4(Ph-C) ,127.8 (Ph-C),127.7(C-7),127.0 (C-8),126.3 (Ph-C) ,122.0(C-3,5),117.0 (C-10,14) ,114.6(C-12),111.7(C=N=O),54.5(-CH2-O),28.8(-CH2-CH2-),28.6(-CH2-CH2-)；m/z (ESI-MS) 1 068.9[M+H2O]+,1 073.7[M+Na]+，綜合分析為預(yù)期化合物4。

2.2 白藜蘆醇與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物體外NO釋放

2.2.1 NO 標準曲線繪制

采用Griess法測定不同濃度NaNO2標準溶液吸光度，繪制標準曲線，計算回歸方程為y=0.004 3x+0.046 5，r=0.999 5。表明NaNO2在250～3.91 μM濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 白藜蘆醇與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物體外NO釋放

考察白藜蘆醇偶聯(lián)物4及中間體化合物2、3的NO的釋放情況，結(jié)果見圖3，在過量半胱氨酸存在下，24 h內(nèi)化合物4釋放較高濃度的NO，達到70.7 μM，為化合物3釋放的近3倍，為其抗癌活性的發(fā)揮奠定了基礎(chǔ)。

圖3 白藜蘆醇呋咱氮氧化物偶聯(lián)物及相關(guān)中間體的NO釋放研究Fig.3 The releasing of NO of conjugate of resveratrol and furoxans and related intermediates

2.3 白藜蘆醇與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物抗腫瘤活性研究

對化合物1、3和4及由化合物1和3按1∶3摩爾比組成的混合物進行MTT抗癌活性實驗，結(jié)果如圖4所示。對A549細胞、HepG2細胞及MCF-7細胞，化合物4均表現(xiàn)出較強的腫瘤抑制活性，IC50值分別為21.65、10.44和41.40 μM，相比于母體化合物1(對同樣細胞IC50值分別為67.48、133.15和95.01 μM)、化合物1+3混合物(對同樣細胞IC50值分別為43.94、100.93和57.74 μM)及化合物3(對同樣細胞IC50值大于400 μM)活性顯著提高，可見，白藜蘆醇與呋咱氮氧化物進行偶聯(lián)，具有較強的協(xié)同效果。因此白藜蘆醇進行NO供體化修飾是發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的一條有效途徑。

圖4 白藜蘆醇呋咱氮氧化物偶聯(lián)物及相關(guān)化合物MTT實驗結(jié)果Fig.4 The results of MTT for conjugate of resveratrol and furoxans and related compounds

3 結(jié)論

白藜蘆醇為一多功能植物成分，尤其是在抗癌活性領(lǐng)域研究較為活躍；NO為一重要的氣體信使分子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密不可分，而高濃度NO可以抑制腫瘤的生長，本實驗通過把白藜蘆醇與NO供體呋咱氮氧化物進行共價結(jié)合制備了化合物4，該偶聯(lián)物對三種腫瘤細胞A549、HepG2及MCF-7均表現(xiàn)出較強腫瘤抑制活性，IC50值分別為21.65、10.44和41.40 μM，相比于母體化合物腫瘤抑制活性有了明顯的提高，為白藜蘆醇的NO供體化開發(fā)提供了參考。