王 坤，吳 瓊，耿 瑞，王夢玲，馬佑芬，駱 衡,*，晏 晨

1貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴陽 550002；2畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，畢節(jié) 551700； 3遵義醫(yī)學(xué)院，遵義 563006；4德江縣民族中醫(yī)院，德江 565200；5安順市人民醫(yī)院，安順 561000

煙管頭草為菊科(Asteraceae)天名精屬一或兩年生草本，高40～90 cm。莖直立，多分枝，全株密被白毛，單葉互生，全緣或波狀齒，根粗葉大而狹長，柄短，下部葉長橢圓形，上部較小，廣被針形。頭狀花序單生在小枝頂端，初直立，開花時多下垂；總苞片淡綠色，外層總苞片葉狀，內(nèi)層干膜質(zhì) ；花黃色片，全為管狀花。瘦果線形有條紋[1]。煙管頭草具有清熱解毒、消腫止痛的功效，主治感冒發(fā)熱、高熱驚風(fēng)、咽喉腫痛、痄腮、牙痛、尿路感染、淋巴結(jié)核、瘡瘍癤腫、乳腺炎等，貴州苗族地區(qū)將其作為民族藥野煙葉使用[2]。煙管頭草的化學(xué)成分主要有倍半萜、黃酮、苯酚、甾體、木脂素、三萜、香豆素等[3]。研究表明導(dǎo)致前列腺增生主要因素有生長因子通路與激素變化，治療前列腺增生目前有藥物治療與手術(shù)治療，并且近年來，藥物治療成為學(xué)者治療前列腺增生研究熱點，但煙管頭草治療前列腺增生的研究及活性成分鮮有報道，并且本研究預(yù)實驗表明，煙管頭草粗提物對前列腺增生細(xì)胞(BPH1)增殖有抑制作用，有凋亡現(xiàn)象。因此，本研究就煙管頭草粗提物對前列腺增生細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡進行初步探究，確定其是否可誘導(dǎo)前列腺增生細(xì)胞(BPH1)凋亡，并從調(diào)控前列腺增生細(xì)胞凋亡Wnt信號通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)的角度探討其可能的抗前列腺增殖分子機制[4]，以期望為進一步研究煙管頭草的抗前列腺增殖活性成分及其機制奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑

DEME高糖培養(yǎng)基(HyClone，美國，AC10254368)；0.25% Trypsin胰酶(HyClone，美國，T1320)；胎牛血清(杭州四季青公司，中國，20171221)；四甲基偶氮唑藍(lán)(3-(4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl-tetrazolium bromide；MTT) (Sigma 公司，美國，G1724034)；二甲基亞砜(北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，中國，D8370)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，中國，20171222)；Gold view I型核酸染料(北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，中國，G8140)；Wnt通路基因(β-catenin、C-myc、SFRPS2、CyclinD1、ddk1、fzd2 、GAPDH)引物(上海生工科技有限公司，中國)；瓊脂糖(BIOWEST公司，中國，111860)；DNA Ladder抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，中國，C0007)；Hoechest染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，中國，C0003)；Matrigel? Matrix(Corning公司，美國，356234)；50×TAE(康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國，CW06635)；Super DNA Marker(康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國，CW25835)。其它相關(guān)試劑為分析純級別的國產(chǎn)試劑。

1.2 實驗儀器

熒光倒置顯微鏡(卡爾·蔡司股份公司，德國)；倒置顯微鏡(ECLIPSE TS100-F)(日本尼康有限公司產(chǎn)品，日本，ECLIPSE TS100-F)；NANODROP 2000(賽默飛世爾科技公司，中國)；超凈臺(賽默飛世爾科技公司，中國，1384)；培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技公司，中國3111)；高速離心機(BECKMAN COULTER公司，美國)；凝膠成像儀(Gene Company Limited，中國香港)；電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，JY300HE)；PCR儀(Applied Biosystems(ABI)，美國，9902)。

1.3 煙管頭草粗提物的制備

樣品采自貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為菊科(Asteraceae)天名精屬(CarpesiumL.)植物煙管頭草(Carpesiumcernuum)。黔產(chǎn)藥用煙管頭草的提?。呵a(chǎn)藥用煙管頭草(Carpesiumcernuum)的全草干重20.0 kg，用95% 的工業(yè)乙醇將粉碎后的藥材加熱回流提取，每次3 h，共提取3次，將提取液合并，回收CH3CH2OH。然后加水使?jié)饪s液呈懸浮狀態(tài)，用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取液與水層，乙酸乙酯萃取物616 g，-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

所用的細(xì)胞株由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物重點實驗室腫瘤藥理課題組保存。將保存的人前列腺增生BPH1細(xì)胞于37 ℃ 水浴中迅速解凍，離心收集細(xì)胞后，用含10% 胎牛血清及1% 青霉素、1% 鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞80% 匯合時進行傳代及保種，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

2.2 MTT檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入190 μL細(xì)胞液，分別設(shè)置3個復(fù)孔，設(shè)置空白組與對照組，于37 ℃、5% CO2恒溫飽和濕度下培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，吸干培養(yǎng)液，加入用新鮮培養(yǎng)液配好的各濃度的提取物，對照組為同比例稀釋的DMSO，空白組加入同體積培養(yǎng)液，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，3 200 rpm離心15 min，加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，1 500 rpm離心8 min，吸出培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO溶解結(jié)晶物，搖床低速震蕩10 min，采用多功能酶標(biāo)儀于490 nm處檢測其OD值，并計算其細(xì)胞增殖抑制率[5,6]。

2.3 Tanswell檢測

4 ℃解凍Matrigel膠，使其成為液體；用無血清的DMEM培養(yǎng)基將Matrigel膠按照7∶1比例稀釋；每孔加入50 μL稀釋的Matrigel于Tanswell小室濾膜上層。37 ℃、5% CO2孵育30 min。將對數(shù)期的細(xì)胞離心收集，用培養(yǎng)基將收集的細(xì)胞稀釋成1×104個/mL，將細(xì)胞與不同濃度提取物混勻接種于上層無血清的培養(yǎng)液中，下層為含血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h；取出小室，用生理鹽水沖洗3次，用棉簽小心擦去小室Matrigel膠，加入無水甲醇浸泡10min；室溫靜置15 min，每孔加入300 μL 0.1%的結(jié)晶紫染色30 min，生理鹽水沖洗3次，晾干，取染色的小室顯微觀察拍照，分別取上下左右及中間五個視野計數(shù)，多次重復(fù)求平均值，并作統(tǒng)計學(xué)分析[7]。

2.4 HE染色

取潔凈的蓋玻片在75% 乙醇中浸泡5 min，無菌超凈臺內(nèi)用0.9%生理鹽水沖洗三次，再用培養(yǎng)液沖洗一次，將洗凈滅菌的蓋玻片平置于六孔板內(nèi)。將對數(shù)期收集并稀釋為1×104個/mL的細(xì)胞懸液2 mL接種于上述的六孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)待其貼壁后，加入不同濃度的提取物繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，離心后吸去大部分液體保留50 μL液體，再緩緩懸起細(xì)胞，滴加至載玻片上盡量使細(xì)胞分布均勻；加入0.5 mL固定液，固定10 min；去固定液，用0.9% 生理鹽水沖洗兩次，每次3 min；加入0.5 mL Hoechst 33258染色液振動染色5 min；去染色液，用0.9% 生理鹽水洗兩次，每次3 min，吸盡液體，加入一滴抗熒光淬火封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，熒光顯微鏡檢測其細(xì)胞核的變化[8]。

2.5 DNA Ladder檢測

取對數(shù)期生長的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL；將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長貼壁后，加入不同濃度的提取物，DMSO處理為空白對照，培養(yǎng)48 h后用胰酶消化，用生理鹽水沖洗1次，1 500 g離心2 min，棄上清，收集細(xì)胞；用DNA Ladder抽提試劑盒抽提DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其DNA損傷程度[9]。

2.6 RT-PCR檢測細(xì)胞基因表達(dá)

收集不同濃度提取物處理48 h的細(xì)胞，按照文獻[10]報道方法去取總RNA，1% 的瓊脂糖電泳液檢測RNA的完整性。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，按照文獻[10]，利用1% 的瓊脂糖電泳液檢測不同基因(引物序列見表1)的PCR產(chǎn)物，凝膠成像分析差異表達(dá)結(jié)果[11]。

表1 本研究中檢測的相關(guān)基因的引物序列

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有的數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0 軟件(IBM SPSS Statistics 22.0，USA)做統(tǒng)計學(xué)分析，所有結(jié)果以均值表示。采用F-檢驗進行差異性分析，顯著差異表示為(*P< 0.05；**P< 0.01)。

3 結(jié)果

3.1 煙管頭草粗提物對前列腺增生(BPH1)細(xì)胞增殖活性的影響

倒置顯微(×100)觀察不同濃度處理對BPH1細(xì)胞生長及形態(tài)的影響(圖1 A)，正常(Control)細(xì)組胞貼壁生長，呈帶狀或條狀，胞質(zhì)飽滿，細(xì)胞融合成群落；而實驗組細(xì)胞數(shù)量減少，間隙增大，體積減小，染色質(zhì)凝聚、有凋亡小體出現(xiàn)等特點，并且作用效果成濃度依賴性，即濃度越大，藥物度對BPH1細(xì)胞作用越明顯。MTT檢測煙管頭草粗提物對BPH1細(xì)胞增殖的影響(圖1 B)實驗表明，粗提物對細(xì)胞作用呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，也即作用效果與濃度和時間成正相關(guān)。經(jīng)IBM SPSS Statistics 22.0軟件分析，作出IC50值圖(圖1 C)，實驗組24 h、48 h、72 h的IC50值分別為72.76 μg/L、30.42 μg/L、25.69 μg/L，表明實驗組IC50值與時間成負(fù)相關(guān)，即時間越長，濃度越小，并且與24 h組比較，48 h與72 h差異性顯著(*P< 0.05)。因此，煙管頭草粗提物對前列腺增生細(xì)胞增殖活性有顯著影響。

圖1 煙管頭草粗提物對前列腺增生細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 Effect of Carpesium cernuum crude extract on proliferative activity of benign prostatic hyperplasia注：與空白對照組比較，* P < 0.05，** P < 0.01。A.倒置顯微鏡觀察提取物對BPH1細(xì)胞形態(tài)變化的影響；B.煙管頭草粗提物對前列腺增生細(xì)胞生長的影響;C.粗提物對BPH1細(xì)胞作用的IC50值* P<0.05,** P<0.01。Note:Compared with control group,* P<0.05,**P<0.01.A.Inverted microscope to observe the effect of >extracts on the morphological changes of BPH1 cells;B.Effect of Carpesium cernuum crude extract on the growth of benign prostatic hyperplasia cells;C.IC50 value of crude extracts on BPH1 cells.

3.2 Transwell實驗

體外侵襲能力檢測實驗：倒置顯微鏡(×100)觀察(圖2A)表明隨著藥物濃度的增大，視野數(shù)目逐漸減少，呈現(xiàn)濃度依賴性。統(tǒng)計學(xué)處理(圖2B)表明，對照組(0 μg/L)，實驗組(20、40、80 μg/L)其透過濾膜平均數(shù)分別為123、34、18、10個，與對照組(0 μg/L)比較，實驗組20、40、80 μg/L差異性顯著(P<0.01)，進一步驗證了藥物對細(xì)胞侵襲力的影響呈現(xiàn)濃度依賴性。因此，侵襲實驗表明：藥物能顯著降低細(xì)胞的侵襲潛能。

3.3 粗提物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡研究

細(xì)胞凋亡染色實驗(圖3)表明正常細(xì)胞(Control)呈現(xiàn)淡藍(lán)色，偶爾有帶蒼白色；而加入藥物后的細(xì)胞大多呈現(xiàn)蒼白色，并且濃縮成圓形。染色質(zhì)斷裂是細(xì)胞凋亡時主要的生化特征，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖(圖4)譜(DNA ladder)，本研究用兩種濃度處理 BPH1細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，與對照組 DNA ladder 有明顯不同，藥物處理后細(xì)胞出現(xiàn)典型的 DNA ladder，說明細(xì)胞已經(jīng)凋亡。因此，凋亡染色試驗和DNA ladder實驗表明：藥物能夠誘導(dǎo) BPH1細(xì)胞凋亡。

3.4 RT-PCR檢測

RT-PCR實驗(圖5)結(jié)果表明：GAPDH基因在BPH1正常表達(dá)，實驗組與GAPDH相比，實驗組SFRPS2 、C-myc、β-catenin基因組表達(dá)均高于內(nèi)參組，ddk1、fzd2、cyclinD1表達(dá)均低于內(nèi)參組。與control組相比，SFRPS2 、C-myc、β-catenin是隨著濃度的增大而增加；ddk1、fzd2表達(dá)是隨濃度的增大，表達(dá)能力增強，但顯著低于內(nèi)參組，cyclinD1組表達(dá)能力是隨著濃度的增大而降低。因此，粗提物誘導(dǎo)BPH1細(xì)胞凋亡是與Wnt信號通路關(guān)鍵基因的表達(dá)有關(guān)。

圖2 煙管頭草粗提物對前列腺增生細(xì)胞體外侵襲能力的影響Fig.2 Effect of crude extract of Carpesium cernuumon in vitro invasive ability of benign prostatic hyperplasia cells注：與空白對照組比較，** P < 0.01。A.顯微(×100)觀察圖；B.透過濾膜平均值。Note:Compare with control,** P < 0.01.A.microscopic (x100) observations;B.Average of filtration membranes.

圖3 HE染色檢測煙管頭草粗提物誘導(dǎo)前列腺增生細(xì)胞凋亡Fig.3 HE staining was used to detect the apoptosis of prostate hyperplasia cells induced by crude extractof Carpesium cernuumon 注：A.Control組；B.圖為20 μg/L粗提物處理。Note:A.Control group;B.20 μg/L crude extract treatment.

4 結(jié)論

前列腺增生癥即良性前列腺增生(Benign prostatic hyper-plasia，BPH) ，是中老年男性常見疾病。隨著老齡化人口日益增加，BPH 的發(fā)病率逐年上升，50 歲以上男性，約 90% 有不同程度的前列腺增生，已嚴(yán)重威脅中老年男性的健康。國際良性前列腺增生咨詢委員會定義 BPH 為存在良性前列腺長大，或前列腺移行區(qū)長大的客觀證據(jù)，有下尿路癥狀(LUTS) ，或下尿路癥狀加重及上尿路受損，存在膀胱出口梗阻[12]。主要臨床表現(xiàn):進行性尿頻、尿線變細(xì)、排尿費力、尿潴留等，重癥患者可導(dǎo)致腎積水、腎功能衰竭等病癥[12]。有研究表明，生長因子通路是調(diào)控前列腺增生直接主要因素；雌雄激素紊亂，是前列腺增生源頭；凋亡紊亂，由生長因子及激素變化誘導(dǎo)，也是前列腺增生的病理表現(xiàn)，而在前列腺增生發(fā)生發(fā)展中，激素內(nèi)分泌學(xué)說和生長因子學(xué)說也具重要地位和作用[12]。有研究中藥及其活性成分可從多方面、多靶點治療 BPH，現(xiàn)有研究多為調(diào)節(jié)雌激素、雄激素，改善微循環(huán) 及增強免疫，并且也有研究證實、牽牛子、川芎、當(dāng)歸、白芥子、王不留行、水蔓青等可通過改善 BPH動物模型的各種指標(biāo)[12]。近年來，國內(nèi)對 BPH1研究取得較大進展，現(xiàn)已證實藥物干預(yù)防治前列腺增生癥與多種因素密切相關(guān)。有學(xué)者擬通過虛擬篩選、分子水平篩選、細(xì)胞水平篩選和整體動物篩選，進行藥物的篩選[13]研究。煙管頭草常以全草入藥，其化學(xué)成分和藥理作用報道較多，含有倍半萜、黃酮、醇、酯、苯酚、甾體、木脂素、三萜、香豆素等，如天名精內(nèi)酯酮(Carab-rone)，天名精內(nèi)酯醇(Carabrol)與特勒內(nèi)酯(Telekin)[14]，鶴大葉土木香內(nèi)酯(Granilin)，11(13)-去氫腋生依瓦菊素[11(13)-dehydroivaxillin][15]等，藥理活性報道有清熱瀉火、涼血解毒、抗病毒抗菌殺蟲[16-19]作用，但是在利用煙管頭草粗提物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗前列腺細(xì)胞作用方面的研究較少涉及。因此，本研究就其抗前列腺細(xì)胞增殖活性及其機制進行初步探究。實驗表明：煙管頭草粗提物對前列腺增生細(xì)胞(BPH1)的增殖抑制作用具有選擇性，可顯著抑制前列腺增生細(xì)胞(BPH1)的增殖，并且呈現(xiàn)顯著的時間和濃度依賴性；熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量與狀態(tài)顯著改變，且有凋亡小體出現(xiàn)；Transwell實驗表明煙管頭草粗提物可降低BPH1細(xì)胞侵襲潛能；Heston染色實驗及DNA ladder表明提取物可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；分子生物學(xué)實驗結(jié)果表明粗提物可在轉(zhuǎn)錄水平顯著調(diào)控Wnt信號通路中β-catenin、SFRPS2、cyclinD1、ddk1、fzd2、C-myc基因表達(dá)。煙管頭草作為民族藥，資源豐富，醫(yī)用前景大，而本研究為分離煙管頭草的抑制人前列腺增生(BPH1)活性成分及綜合利用提供了實驗依據(jù)。

圖4 DNA Ladder檢測煙管頭草粗提物誘導(dǎo)前列腺增生細(xì)胞凋亡Fig.4 DNA Ladder detection of Carpesium cernuumon crude extract induces apoptosis of benign prostatic hyperplasia

圖5 轉(zhuǎn)錄水平檢測煙管頭草粗提物對前列腺增生細(xì)胞中Wnt信號通路的關(guān)鍵基因表達(dá)的影響Fig.5 The effect of expression of key gene transcription level detection of Carpesium cernuumon extract on Wnt signaling pathway in the cells of the prostate hyperplasia