孟令嬌，丁平安，巨英超，劉思樺，常勝，韓若琦，潘爍，劉飛，谷麗娜，桑梅香

0 引言

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤，在女性癌癥相關(guān)死因中居第二位[1]。中國乳腺癌的發(fā)病率占世界總發(fā)病率的12.2%，死亡率高達9.6%，嚴(yán)重危害我國女性的身體健康和生活質(zhì)量[2]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人類表皮生長因子受體2（HER2）均呈陰性表達的乳腺癌，惡性程度高，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移[3-4]。雖然目前對乳腺癌的診斷及治療已取得一定成效，但三陰性乳腺癌的患者在1～3年內(nèi)極易復(fù)發(fā)，并且大多于治療后的5年內(nèi)死亡[5]。針對以上問題，快速、準(zhǔn)確地找到TNBC更有效的生物靶標(biāo)成為關(guān)鍵所在。

環(huán)狀RNA（circRNA）是生物體內(nèi)廣泛存在的一類具有調(diào)節(jié)功能的非編碼RNA[6]。它們一般頭尾連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因為不含5'末端帽和3'末端poly （A）尾而表達穩(wěn)定[7-8]。第一個環(huán)狀RNA ciRS-7 （CDR1as）由 Hansen等首次發(fā)現(xiàn)，其可作為miR-7海綿在大腦中穩(wěn)定表達并發(fā)揮重要的基因調(diào)控功能[9]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，ciRS-7敲除后的體內(nèi)動物模型出現(xiàn)了miR-7和miR-671表達失調(diào)，最終影響哺乳動物的大腦發(fā)育功能[10]。ciRS-7主要通過miRNA海綿的方式調(diào)節(jié)miR-7的表達，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[9]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA可調(diào)節(jié)人類多種腫瘤的進展。三陰性乳腺癌作為一類高度惡性的腫瘤，其潛在的分子機制仍有待闡明，而且環(huán)狀RNA對其發(fā)病的調(diào)控作用尚未見報道。

本研究旨在探討環(huán)狀RNA ciRS-7在三陰性乳腺癌（TNBC）中的表達及其對細(xì)胞侵襲和遷移的影響，為尋找TNBC新型腫瘤生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

表1 PCR引物序列及反應(yīng)條件Table1 PCR primer sequences and reaction requirement

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年9月—2017年10月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院接受手術(shù)治療的乳腺癌患者132例，其中Luminal型89例、TNBC25例和HER2過表達型18例。所有患者均未接受術(shù)前化療和放療。所有腫瘤組織均由經(jīng)驗豐富的病理學(xué)專家證實。所有患者均簽署了知情同意書，研究方案征得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDAMB-453、BT-549和MCF-7購自美國ATCC細(xì)胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，胎牛血清購自上海依科賽生物制品有限公司。TRIzol購自美國Invitrogen公司，Platinum SYBR Super Mix試劑、Fu GENE HD轉(zhuǎn)染試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Promega公司，PCR引物購自英濰捷基貿(mào)易有限公司。Transwell小室（孔徑3.0 μm）購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。ciRS-7 siRNA購自廣州銳博生物科技公司。

1.3 qRT-PCR法檢測ciRS-7在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達

乳腺癌組織和細(xì)胞用TRIzol裂解后提取總RNA，按照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA，然后進行實時熒光定量PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參，環(huán)狀RNA ciRS-7來源于CDR1as，于是本實驗設(shè)計兩種引物，一種為發(fā)散引物，可擴增出環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本ciRS-7，另一種為聚合引物，能擴增CDR1as的線性轉(zhuǎn)錄本。然后以任意兩例TNBC組織和兩種TNBC細(xì)胞系（MDA-MB-231和BT-549）的cDNA和基因組DNA（gDNA）為模板，進行普通PCR反應(yīng)。目的基因的引物序列及反應(yīng)條件見表1。利用各實驗組目的基因及內(nèi)參基因的Ct值，按照公式ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.4 RT-PCR法檢測ciRS-7在TNBC 細(xì)胞中的表達

如1.3提取細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴增，GAPDH為內(nèi)參，目的基因的引物序列及反應(yīng)條件，見表1。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后進行核酸顯色。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

人TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231和BT-549用含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37℃、5%CO2體積分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)箱中。按Fu GENE HD轉(zhuǎn)染試劑說明書方法將ciRS-7 siRNA轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞中，并在兩種細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染control siRNA作為對照。

圖1 環(huán)狀RNA ciRS-7在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達Figure1 Expression of circular RNA ciRS-7 in breast cancer tissues and cell lines

1.6 劃痕實驗檢測敲低ciRS-7后的細(xì)胞遷移能力

收集對數(shù)期的MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個每毫升，取2 ml接種于6孔板，并在6孔板背面劃5條平行線做標(biāo)記，24 h后用200 μl槍頭在細(xì)胞中劃2條垂直于背面平行線的直線，PBS沖洗2次，加入2 ml無胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于0、24 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞向劃痕中間遷移的距離并拍照，每組實驗設(shè)3個平行孔。

1.7 Transwell小室檢測敲低ciRS-7后的細(xì)胞遷移和侵襲能力

取對數(shù)期生長的細(xì)胞懸液，加入Transwell小室的上室（2×105個/小室），小室上鋪膠檢測侵襲能力，不鋪膠者檢測遷移能力；下室加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)48 h，用棉簽擦凈上室細(xì)胞，PBS清洗后，結(jié)晶紫染色，倒置相差顯微鏡下（×200）觀察并拍照，隨機選取5個視野，計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.8 動物實驗

所有動物實驗均經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動物保護委員會批準(zhǔn)。選用4周齡BALB/c裸鼠，隨機分為2組（每組8只）。用si ciRS-7或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞（每只小鼠5×106個細(xì)胞）分別經(jīng)尾靜脈注射BALB/ c裸鼠中。 然后將50 OD膽固醇修飾的siciRS-7或?qū)φ誷iRNA經(jīng)尾靜脈注射到BALB/c裸鼠中（每周2次）。2月后處死裸鼠，解剖肺組織。肉眼檢查肺的外觀，然后進行HE染色，并在顯微鏡下觀察每個視野肺組織切片的轉(zhuǎn)移克隆數(shù)。

上述實驗均重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（±s）表示，兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)狀RNA ciRS-7在TNBC組織和細(xì)胞中穩(wěn)定高表達

結(jié)果顯示，環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本ciRS-7只能用發(fā)散引物在cDNA中檢測到，gDNA中未見擴增產(chǎn)物；但是線性形式的CDR1as在cDNA和gDNA中均出現(xiàn)了擴增產(chǎn)物，見圖1A、B。這說明本研究使用的環(huán)狀RNA ciRS-7引物的有效性，并進一步驗證了其在TNBC中具有一定的表達豐度。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，TNBC樣本中ciRS-7的相對表達量為（6.52±0.38），顯著高于Luminal型（1.56±0.17）（P＜0.001）和HER2過表達型乳腺癌組織（2.27±0.66）（P＜0.001）以及癌旁正常組織（0.83±0.09）（P＜0.001），見圖1C。ciRS-7在TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231和BT-549中高表達，但在Lunimal型MCF-7細(xì)胞和HER2過表達型MDA-MB-453細(xì)胞中低表達，見圖1D。qRT-PCR方法進一步證實ciRS-7對RNase R的抗性，MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞經(jīng)RNase R處理后CDR1線性基因表達明顯下降，而環(huán)狀形式的ciRS-7無明顯變化，見圖1E。綜上表明，環(huán)狀RNA ciRS-7在TNBC組織和細(xì)胞中穩(wěn)定高表達。

2.2 環(huán)狀RNA ciRS-7與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

為方便分析數(shù)據(jù)，將所有乳腺癌組織分類為ciRS-7高表達組和低表達組，使用132例乳腺癌患者組織中ciRS-7的平均相對表達量（4.82）作為所有乳腺癌患者的臨界閾值。132例乳腺癌患者中ciRS-7高表達組32例，低表達組100例；ciRS-7表達與患者年齡、腫瘤直徑和病理分級無關(guān)（均P＞0.05），而與分子分型、腫瘤浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（均P＜0.05），見表2。由此推斷ciRS-7可能與乳腺癌患者的病情進展密切相關(guān)，于是本實驗重點研究高表達ciRS-7且惡性度高的TNBC型乳腺癌。

2.3 敲低ciRS-7可能抑制TNBC細(xì)胞的遷移能力

劃痕實驗結(jié)果顯示siRNA介導(dǎo)的ciRS-7敲低組MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞的遷移能力明顯被抑制，見圖2A；轉(zhuǎn)染ciRS-7 siRNA后兩株細(xì)胞的ciRS-7表達明顯降低 （均P=0.000），見圖2B，證明本研究中針對環(huán)狀RNA ciRS-7 siRNA干擾有效；實驗組和對照組兩株細(xì)胞遷移面積變化百分率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2C （均P=0.000）。綜上表明siRNA介導(dǎo)的ciRS-7敲低可能抑制TNBC細(xì)胞的遷移能力。

表2 ciRS-7表達與132例乳腺癌患者臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性Table2 Correlation between ciRS-7 expression and clinicopathological parameters of 132 breast cancer patients

2.4 敲低ciRS-7可能抑制TNBC細(xì)胞的遷移和侵襲能力

與si ctrl組相比，si ciRS-7處理組MDAMB-231和BT-549細(xì)胞的穿膜數(shù)目明顯減少，見圖3A。MDA-MB-231和BT-549中對照組和實驗組的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.000），見圖3B、C。

圖2 沉默ciRS-7對MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞遷移的影響Figure2 Effect of silencing ciRS-7 on migration of MDA-MB-231 and BT-549 cells

2.5 敲低ciRS-7可能抑制裸鼠體內(nèi)TNBC的肺轉(zhuǎn)移

通過尾靜脈注射建立MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型。與si ctrl組相比，si ciRS-7組裸鼠的肺轉(zhuǎn)移能力明顯較弱，見圖4A。顯微鏡下觀察si ciRS-7轉(zhuǎn)染組的裸鼠形成的肺轉(zhuǎn)移克隆數(shù)比si ctrl轉(zhuǎn)染組的明顯減少（P=0.000067），見圖4B。表明敲低ciRS-7可能抑制裸鼠體內(nèi)TNBC的肺轉(zhuǎn)移能力。

圖3 沉默ciRS-7對MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞遷移和侵襲的影響Figure3 Effect of silencing ciRS-7 on migration and invasion of MDAMB-231 and BT-549 cells

圖4 沉默ciRS-7對裸鼠體內(nèi)TNBC的肺轉(zhuǎn)移的影響Figure4 Effect of silencing ciRS-7 on lung metastasis of TNBC in nude mice

3 討論

本課題組檢測了132例乳腺癌患者病理組織標(biāo)本及配對癌旁正常組織中ciRS-7的表達水平，分析ciRS-7與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。另外檢測了乳腺癌細(xì)胞系中ciRS-7的表達水平，通過體外細(xì)胞功能實驗檢測ciRS-7對TNBC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，體內(nèi)動物實驗探究敲低ciRS-7后TNBC發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的變化，為尋找TNBC的新型腫瘤生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

由于當(dāng)時研究技術(shù)的局限性，環(huán)狀RNA在發(fā)現(xiàn)之初被認(rèn)為是錯誤剪接或內(nèi)含子套索過程中形成的副產(chǎn)物[11-13]。近年來隨著RNA測序（RNA-seq）技術(shù)的不斷發(fā)展，大量環(huán)狀RNA在小鼠、線蟲及人類細(xì)胞中被檢測到[14-15]。circRNA的功能包括與AGO蛋白結(jié)合調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯過程[6]，與RNA結(jié)合蛋白相互作用參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[16]。還有一類位于細(xì)胞核內(nèi)的環(huán)狀RNA通過抑制內(nèi)含子環(huán)化正向調(diào)控其宿主基因的表達[17]。但目前研究最為深入的還是其作為miRNA分子“海綿”發(fā)揮生物學(xué)功能。

有報道稱ciRS-7可作為miR-7的分子海綿參與多種癌癥相關(guān)通路影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。胃癌中ciRS-7表達上調(diào)，進而影響miR-7下游的PTEN/PI3K/AKT信號通路，促進癌癥的發(fā)生發(fā)展[19]。食管鱗狀細(xì)胞癌中過表達的ciRS-7可通過靶向miR-876-5p，解除其對腫瘤相關(guān)抗原MAGE-A家族的抑制作用從而加速ESCC進程[20]。結(jié)腸癌中ciRS-7可直接結(jié)合miR-7影響其下游的EGFR-RAF1信號通路，發(fā)揮關(guān)鍵的促癌作用[21]。ciRS-7還可通過充當(dāng)miRNA分子海綿在非小細(xì)胞肺癌和膀胱癌的進展中發(fā)揮重要作用[22-23]。

然而，ciRS-7在乳腺癌中的研究未見報道。三陰性乳腺癌作為乳腺癌中具有高度轉(zhuǎn)移潛能的分子類型，其調(diào)控機制至今尚未闡明。本研究采用qRT-PCR技術(shù)檢測了4種乳腺癌細(xì)胞系中ciRS-7的表達水平，發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌細(xì)胞系中ciRS-7的表達明顯高于其他類型的乳腺癌細(xì)胞系，這提示ciRS-7可能與TNBC的高侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。

為此本課題組設(shè)計了細(xì)胞遷移和侵襲試驗及裸鼠轉(zhuǎn)移瘤實驗進一步探究ciRS-7對TNBC的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果表明環(huán)狀RNA ciRS-7在體內(nèi)和體外實驗中均可促進TNBC細(xì)胞的侵襲遷移水平。但其具體的分子機制尚未研究透徹，猜測其很可能通過miRNA分子海綿機制發(fā)揮調(diào)控作用，這有待在今后的研究中得到證實。