楊程程，滕軍放，丁雪冰，王雪晶

鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病(cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy， CADASIL)是一種單基因遺傳性腦小血管病，是由位于人類19號染色體短臂上的NOTCH3基因突變所致[1-3]。CADASIL一般中年起病，與傳統(tǒng)的腦血管病不同，其通常無明確的腦血管病高危因素，以反復腦卒中發(fā)作為主要表現(xiàn)，同時可伴隨認知障礙、癡呆、精神情緒紊亂及有先兆的偏頭痛等。繼2000年第1例CADASIL家系在中國被報道之后，共有20多種NOTCH3基因突變逐漸被發(fā)現(xiàn)[4]，全世界成千上萬CADASIL家系在不同種族中被發(fā)現(xiàn)，然而由于不同種族及地域CADASIL的臨床表現(xiàn)、基因突變類型等差異較大，這類疾病仍經(jīng)常被忽視和誤診[5]。MRI上可以發(fā)現(xiàn)較多皮質(zhì)下缺血灶及廣泛的白質(zhì)病變，是診斷CADASIL腦部血管損害的重要手段。目前，CADASIL的診斷除臨床癥狀和影像學檢查之外，最重要的是基因檢測及病理學組織活檢。組織活檢能夠檢驗出血管壁內(nèi)NOTCH3基因編碼蛋白的存在及平滑肌細胞膜和膜外基質(zhì)之間顆粒狀嗜鋨物質(zhì)的存在[6]。由于皮膚組織較中樞神經(jīng)組織容易取材，且皮膚通常也可以發(fā)現(xiàn)顆粒狀嗜鋨物質(zhì)的存在，因此皮膚活檢是此病病理學診斷中經(jīng)常采用的檢測方法[7-9]。由于我國基因診斷技術應用的局限性，經(jīng)病理及基因檢測確診的CADASIL家系在國內(nèi)較少，且目前關于NOTCH3基因突變熱點的報道多位于第3、4、11、12、13、14、18號等外顯子[10]。本文確診了1例NOTCH3基因第6號外顯子基因突變所致的CADASIL家系，報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料2018年5月于鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的1例疑似CADASIL患者，家系圖譜見圖1。患者男，49歲，慢性起病，以“反應遲鈍1 a余”為主訴入院；1 a余前逐漸出現(xiàn)反應遲鈍、記憶力下降、表情減少、主動與人溝通能力下降。5個月前上述癥狀加重，且出現(xiàn)理解力下降、右側肢體無力、步態(tài)不穩(wěn)、言語不利，至北京某醫(yī)院行腦脊液免疫學相關檢查未見異常，栓子檢測、發(fā)泡試驗均未見異常。

查體：意識清楚，精神一般，語言欠流利，記憶力減退，理解力差，計算力差，判斷力正常，右利手。雙側額紋對稱，雙側眼裂對稱，閉目有力，右側鼻唇溝變淺，示齒口角左偏，鼓腮不漏氣。伸舌充分，舌尖位置右偏，無舌肌萎縮及肌束震顫。無肌肉萎縮及假性肌肥大。四肢肌張力正常，左側肢體肌力5級，右側肢體肌力5(-)級。右上肢腱反射稍活躍，左上肢腱反射正常。雙下肢腱反射減弱。雙側指鼻試驗穩(wěn)準，右側跟膝脛試驗欠穩(wěn)準，Romberg征陰性。無不自主運動，步態(tài)正常。右側巴氏征陰性，左側巴氏征可疑陽性。雙側唇反射陽性，雙側掌頦反射陽性。

影像學檢查：頭顱MRI示左側側腦室后角急性梗死灶。雙側額頂葉、雙側半卵圓中心、放射冠、雙側丘腦及基底節(jié)區(qū)、橋腦缺血灶及腔梗。頭顱MRA示顱內(nèi)動脈粥樣硬化，右側椎動脈顱內(nèi)段纖細。頭頸聯(lián)合CTA示主動脈弓局部管壁增厚并點狀鈣斑影，管腔未見明顯狹窄；右側椎動脈較對側纖細，硬膜內(nèi)段為著。結果見圖2。

既往史：吸煙史10余年，無高血壓、糖尿病、高血脂病史。

該家系中先證者父親生前有該病臨床癥狀，先證者及其兄有明確的臨床癥狀，其他現(xiàn)存親屬尚無臨床癥狀。先證者兄(Ⅲ5),52歲，以“反應遲鈍5 a”為主要臨床癥狀，此外疑似伴隨認知功能障礙，拒絕就診。

■男性患者；□正常男性；○正常女性；/已死亡；先證者

圖1先證者家系圖譜

1.2皮膚活檢告知先證者并獲得其知情同意后，取其脛骨前部一塊約1 cm×1 cm大小的皮膚組織進行活檢。對標本進行固定、乙醇脫水、浸蠟包埋、切片、貼片、HE染色，光鏡與電鏡下觀察。

A：MRI T2加權像示雙側頂葉、雙側側腦室旁多發(fā)斑片狀高信號；B： T2 FLair像上雙側頂葉、雙側側腦室后角多發(fā)軟化灶；C：SWI像上雙側丘腦、右側基底節(jié)區(qū)、右側顳頂葉、左側額葉少量含鐵血黃素沉積或微出血灶；D：腦MRA未見明顯局限性狹窄或閉塞；E：CTA示主動脈弓局部管壁增厚并點狀鈣斑影，管腔未見明顯狹窄，右側椎動脈較對側纖細，硬膜內(nèi)段為著

圖2先證者頭顱影像學表現(xiàn)

1.3高通量捕獲測序

1.3.1 全基因組DNA的提取與樣本處理 在知情同意的情況下，采用EDTA抗凝采血管采集先證者、先證者兄、先證者子女外周靜脈血5 mL，-20 ℃保存。然后采用血液提取試劑盒提取血液DNA，取1.5 μg DNA樣本進行超聲打斷，得到150～200 bp的DNA片段。

1.3.2 DNA文庫構建及樣本捕獲 采用KaPa末端修復酶修復DNA，用AMPure磁珠進行純化，并采用KaPa Atailing試劑在DNA 3’端添加A堿基，然后采用KaPa DNA Ligase將Adapter連接到DNA片段上，最后進行文庫模板量平衡的線性擴增，擴增體系為25 μL。反應條件：2×KaPa HiFi HotStart Ready Mix 12.5 μL，PCR Primer Premix 1 μL，Adapter-ligated library DNA 10 μL，加水至總體積25 μL。反應程序如下：98 ℃ 2 min；98 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，8個循環(huán)；72 ℃ 4 min。

真空濃縮DNA文庫樣本進行雜交捕獲。反應條件為：DNA文庫樣本10 μL 95 ℃加熱5 min后，加熱SureSelect雜交緩沖液且置65 ℃，5 min后捕獲探針文庫混合液，65 ℃孵育2 min。取14 μL的雜交緩沖液加入探針文庫混合液中，再將全部樣本文庫溶液加入，65 ℃孵育 24 h。取50 μL鏈霉親和素(SA)包被的Dynal磁珠(Invitrogen公司產(chǎn)品)，用300 μL結合緩沖液洗滌3次后200 μL結合緩沖液重懸Dynal磁珠，并將完成捕獲反應的樣品全部加入，放入翻轉混勻儀中室溫混勻孵育30 min。置磁力架靜置，待磁珠完全吸附至側壁后去上清。200 μL洗滌緩沖液1重懸，放入翻轉混勻儀中室溫混勻孵育15 min。去上清后加200 μL 65 ℃預熱的洗滌緩沖液2重懸，置恒溫混勻儀中孵育10 min，重復3次。用40 μL的洗脫緩沖液重懸磁珠。取20 μL重懸磁珠，使用Agilent公司的試劑盒提供的試劑進行PCR反應。PCR反應條件為：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性30 s；65 ℃復性30 s；72 ℃延伸30 s，14個循環(huán)；72 ℃再延伸4 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用Ampure磁珠進行純化，并進行Qubit定量。

1.3.3 測序 取捕獲后的DNA樣本進行Illumina HiSeq 2500高通量測序。參考美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學院相關指南進行數(shù)據(jù)解讀和生物信息學分析，并與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMDpro)進行比對。

2 結果

2.1皮膚組織活檢結果光鏡下，皮膚組織、表皮基底層色素增多，真皮淺層小血管周圍少許淋巴細胞浸潤(圖3A)，淺、深層部分小血管壁增厚(圖3B)。電鏡下，小動脈管壁可見平滑肌細胞(圖3C)，平滑肌細胞肌膜下密斑豐富(圖3D)，平滑肌細胞膜和膜外基質(zhì)間可見多個嗜鋨顆粒沉積，電子密度不一(圖3E)。

A、B：光鏡(HE，×200)；C、D、E:電鏡

2.2基因檢測結果見圖4。NOTCH3基因第6號外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)一處雜合突變點：c.811T>C，導致氨基酸改變(半胱氨酸>精氨酸)。HGMDpro數(shù)據(jù)庫未見報道。

圖4 NOTCH3基因 第6號外顯子區(qū)的雜合突變(c.811T>C)

3 討論

CADASIL是一種常染色體顯性遺傳性腦動脈病。其臨床特征及影像學表現(xiàn)被逐步認識 。典型的臨床特征包括30歲左右出現(xiàn)的先兆性偏頭痛，伴有皮質(zhì)下梗死并在40歲左右出現(xiàn)相關癥狀，50歲左右開始出現(xiàn)認知功能下降。CADASIL的頭部MRI表現(xiàn)與年齡和疾病階段相關，表現(xiàn)為T2加權像和T2 Flair像上的對稱的、廣泛的大面積高信號，DWI像上可出現(xiàn)彌散受限的高信號病灶，即急性或亞急性腦梗死灶；白質(zhì)病變經(jīng)常累及前顳葉、外囊、額上回和顳極，這些特殊部位的病變對診斷具有高度的敏感性和特異性，但在亞洲人群中，顳葉病變較為少見[10]。本文家系中2例患者的發(fā)病年齡、先證者的影像學表現(xiàn)與之前報道的基本一致。

CADASIL的病理生理機制主要是由于變異的NOTCH3蛋白聚集體(顆粒狀嗜鋨物質(zhì))沉積在中等大小的動脈血管壁的平滑肌細胞表面，造成血管狹窄閉塞，進而導致腦缺血發(fā)作。這種沉積通常為全身性、系統(tǒng)性的，但以腦血管壁上的沉積更顯著，在腦血管以外的區(qū)域，如皮膚和肌肉血管，也可以發(fā)現(xiàn)顆粒狀嗜鋨物質(zhì)的存在[1-3]。NOTCH3基因突變是CADASIL發(fā)病的主要遺傳機制。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)數(shù)千個CADASIL家系，其中200多種不同的NOTCH3基因變異已被證實，而在中國大陸的CADASIL家系中，NOTCH3基因突變熱點主要位于3、4、11、12、13、14號外顯子[11-12]。目前大部分的研究[13]認為在CADASIL家系中，NOTCH3基因突變導致表皮樣生長因子重復區(qū)域內(nèi)半胱氨酸殘基的重復或丟失，從而導致其編碼的跨膜蛋白發(fā)生結構和功能的變化。在本文報道的CADASIL家系中，NOTCH3基因第6號外顯子的突變(c.811T>C)使半胱氨酸變?yōu)榫彼?，破壞了二硫鍵的原有結構，使其編碼的跨膜蛋白失去相應功能，變異的NOTCH3蛋白聚集體(顆粒狀嗜鋨物質(zhì))沉積在中等大小的動脈血管壁的平滑肌細胞表面，造成血管狹窄閉塞，進而導致腦缺血發(fā)作。另外皮膚組織活檢也進一步證實了這種顆粒狀噬鋨物質(zhì)不僅在腦血管內(nèi)沉積，在皮膚血管內(nèi)也有沉積。與之前的發(fā)現(xiàn)的突變類型不同，本文主要報道了1個中國CADASIL家系中新的NOTCH3基因雜合突變類型(c.811T>C)，該突變位點位于第6號外顯子，HGMDpro數(shù)據(jù)庫尚未見報道。

綜上所述，作者的研究為CADASIL的分子遺傳機制提供了新的證據(jù)，若進一步在大樣本中得到證實，則可能預測這一類基因突變導致的臨床表型，提高CADASIL的臨床診治率。