丁 娜，黃 月，田 龍

1)鄭州人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003

缺血誘發(fā)的腦組織功能損傷是臨床上常見(jiàn)的病理過(guò)程，腦缺血能夠誘發(fā)神經(jīng)功能障礙，而神經(jīng)細(xì)胞凋亡是神經(jīng)功能障礙發(fā)生的重要原因之一[1]。miRNA是一種非編碼的小RNA，在人體的多種組織中均有表達(dá)，不僅參與調(diào)控正常細(xì)胞的生理功能，還參與多種疾病的發(fā)生[2-3]。miRNA-210-3p在阿爾茨海默病、腫瘤、缺氧腦水腫等疾病中均有重要作用，還能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡等；大鼠腦組織缺氧缺血后miRNA-210-3p表達(dá)下調(diào)，miRNA-210-3p過(guò)表達(dá)可以減輕缺氧缺血誘發(fā)的腦組織水腫程度；過(guò)表達(dá)miRNA-210-3p具有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用[4-7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外構(gòu)建缺氧海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞損傷模型，探討miRNA-210-3p對(duì)缺氧條件下海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，為明確腦缺氧神經(jīng)損傷發(fā)生機(jī)制及miRNA-210-3p在海馬神經(jīng)元損傷中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司，以含有100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)在培養(yǎng)液中添加體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?；罨虲aspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司；miRNA-210-3p模擬物和陰性對(duì)照模擬物購(gòu)自美國(guó)Cellecta公司；超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性檢測(cè)試劑盒和丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所；活化型Caspase-9(Cleaved Caspase-9)抗體購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司；所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；cDNA合成試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組HT22細(xì)胞分成4組，分別為對(duì)照組、缺氧組、陰性對(duì)照+缺氧組、miRNA-210-3p+缺氧組。缺氧處理方法：HT22細(xì)胞用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，放在連續(xù)充入體積分?jǐn)?shù)95% N2和體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中連續(xù)缺氧培養(yǎng)3 h。放在不充入缺氧氣體的培養(yǎng)箱(37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。陰性對(duì)照+缺氧組、miRNA-210-3p+缺氧組分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照模擬物、miRNA-210-3p模擬物，并在轉(zhuǎn)染后24 h進(jìn)行缺氧培養(yǎng)3 h。陰性對(duì)照模擬物、miRNA-210-3p模擬物轉(zhuǎn)染方法同Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3qRT-PCR檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞中miRNA-210-3p的表達(dá)各組細(xì)胞中添加1 mL的Trizol裂解溶液，按照常規(guī)方法提取總RNA；以10 μL的反轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，4 ℃終止反應(yīng)。miRNA-210-3p上游引物為5’-ATTATACAATAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’，下游引物為5’-TAAAATATTACTGTGCGTGTGA CAGCGG-3’；內(nèi)參U6上游引物為5’-CGTGCTTCG GCAGCACATAT-3’，下游引物為5’-TTTGCGTGT CATCCTTGCG-3’。PCR反應(yīng)體系：5.0 μL 5×SYBR Green熒光染料，3.4 μL DEPC水，0.2 μL上、下游引物，1.0 μL cDNA樣品，0.2 μL ROX。PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-210-3p的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況收集4組細(xì)胞，分別添加400 μL的Loading Buffer混勻后，依次添加各5 μL的PI和Annexin V-FITC溶液，混勻后置于避光條件下結(jié)合15 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Westernblot檢測(cè)CleavedCaspase-3和CleavedCaspase-9蛋白表達(dá)水平4組細(xì)胞分別添加體積比100∶1的RIPA、PMSF裂解液，充分裂解后，吸取上清，添加至5×上樣緩沖液中混勻煮沸5 min。分別配制100 g/L的電泳分離膠和50 g/L的電泳濃縮膠，在每個(gè)孔中加入40 μg的蛋白樣品，調(diào)整電壓(濃縮膠中的電壓為80 V，分離膠中的電壓為110 V)，觀察溴酚藍(lán)電泳至分離膠的底部以后方可停止電泳。取出凝膠，在300 mA電流條件下把凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，轉(zhuǎn)膜操作置于冰上進(jìn)行。稱(chēng)取5 g的脫脂奶粉加入到100 mL的TBST中配制成封閉液，把NC膜放在封閉液中孵育1 h后，再把NC膜放在Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9抗體反應(yīng)液中孵育2 h，繼續(xù)與二抗反應(yīng)液結(jié)合反應(yīng)2 h，添加ECL顯色液，用Quantity One掃描曝光條帶的灰度值，內(nèi)參為GAPDH。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性和MDA含量檢測(cè)4組細(xì)胞按照1.2方法處理以后，分別用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量，用二硫代二硝基苯甲酸法檢測(cè)GSH-Px活性，用水溶性四唑鹽法檢測(cè)SOD活性，步驟均同試劑盒說(shuō)明書(shū)，結(jié)果均以對(duì)照組細(xì)胞為參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。4組細(xì)胞中miRNA-210-3p相對(duì)表達(dá)量、凋亡率、Cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量、Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量、SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞中miRNA-210-3p表達(dá)水平的比較結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，miRNA-210-3p模擬物轉(zhuǎn)染后的海馬神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后，細(xì)胞中miRNA-210-3p表達(dá)水平升高。

表1 4組細(xì)胞中miRNA-210-3p相對(duì)表達(dá)量的比較

F=36.830，P<0.001；*：與缺氧組、陰性對(duì)照+缺氧組比較，P<0.05

2.2 4組細(xì)胞凋亡率和CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-9蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果見(jiàn)圖1和表2?？梢钥闯?，缺氧處理后的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平升高；miRNA-210-3p模擬物轉(zhuǎn)染后的海馬神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后，細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平下降。

1：對(duì)照組；2：缺氧組；3：陰性對(duì)照+缺氧組；4：miRNA-210-3p+缺氧組

圖1 4組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白的表達(dá)

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與缺氧組、陰性對(duì)照+缺氧組比較，P<0.05

2.3 4組細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的比較結(jié)果見(jiàn)表3。可以看出，缺氧處理后的海馬神經(jīng)細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高；miRNA-210-3p模擬物轉(zhuǎn)染后的海馬神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后，細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低。

表3 4組細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較(n=3)

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與缺氧組、陰性對(duì)照+缺氧組比較，P<0.05

3 討論

缺血性腦疾病嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，缺氧缺血條件可以引起海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，造成海馬組織結(jié)構(gòu)損傷，從而導(dǎo)致腦組織功能障礙[8]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，缺氧處理后的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高，說(shuō)明成功構(gòu)建了缺氧海馬神經(jīng)細(xì)胞體外損傷模型。

miRNA是一類(lèi)由21～23個(gè)堿基組成的單鏈RNA，其不含有開(kāi)放閱讀框，不能編碼蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)分化、血管形成、新陳代謝等過(guò)程[9-11]。目前發(fā)現(xiàn)miRNA-210-3p具有抑制電子傳遞鏈復(fù)合體表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管新生等作用，在腫瘤等疾病中具有重要作用[12]。最近的研究[13]顯示，缺氧缺血后的大鼠腦組織中miRNA-210-3p表達(dá)下降，miRNA-210-3p具有抑制缺血大鼠腦組織水腫的作用。另外，miRNA-210-3p具有抑制氧化應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞凋亡的作用，下調(diào)miRNA-210-3p具有誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用[14]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，缺氧處理后的海馬神經(jīng)細(xì)胞中miRNA-210-3p表達(dá)水平降低，而上調(diào)miRNA-210-3p表達(dá)可以降低缺氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，這說(shuō)明miRNA-210-3p具有抗缺氧海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。

細(xì)胞凋亡在機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持中具有重要作用，無(wú)論是病理性還是生理性的細(xì)胞凋亡都受到細(xì)胞內(nèi)多種基因的嚴(yán)格調(diào)控作用。目前研究較為透徹的細(xì)胞凋亡機(jī)制與Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)，Caspase蛋白家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮不同的功效，Caspase-3和Caspase-9分別位于該凋亡反應(yīng)的下游和上游，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮執(zhí)行和起始因子的作用，二者只有被活化才具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能[15-16]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，上調(diào)miRNA-210-3p后的海馬神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后，細(xì)胞中的Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平降低，提示上調(diào)miRNA-210-3p可能通過(guò)抑制Caspase來(lái)減少缺氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

眾所周知，腦缺血損傷與組織氧化應(yīng)激有關(guān)，而組織內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)可以激活細(xì)胞中Caspase凋亡反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。MDA是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化的產(chǎn)物，而細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性降低導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的氧自由基積累是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)發(fā)生的重要原因，SOD、GSH-Px是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，其活性的高低與細(xì)胞氧化應(yīng)激水平有關(guān)[18-19]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，上調(diào)miRNA-210-3p可以提高缺氧條件下海馬神經(jīng)細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性，同時(shí)降低細(xì)胞中MDA含量，說(shuō)明上調(diào)miRNA-210-3p能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷。

總之，上調(diào)miRNA-210-3p在缺氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，其可能通過(guò)抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激、下調(diào)細(xì)胞Caspase凋亡反應(yīng)發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用，這為研究缺氧海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷提供了參考。