李雨晴,劉紅春,朱 峰)

1)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院檢驗(yàn)科 鄭州 450046 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)檢驗(yàn)系 鄭州 450052

膀胱癌指發(fā)生在膀胱黏膜的惡性腫瘤, 可發(fā)生于任何年齡，發(fā)病率、死亡率高，男性膀胱癌發(fā)病率為女性的3～4倍[1]。研究膀胱癌的發(fā)病機(jī)制，找到可診斷和治療膀胱癌的生物標(biāo)志物尤為重要。微小RNA(miRNA)是一種大小為18～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，它通過抑制蛋白質(zhì)翻譯或促進(jìn)mRNA降解來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等[2]。黏結(jié)合蛋白多糖-2(syndecan-2)屬于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)家族，在絕大多數(shù)上皮和非上皮源性腫瘤中表達(dá)。多配體蛋白聚糖家族廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、血管生成等，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。有研究[4-7]表明，一些miRNA可以調(diào)控HSPG的合成和降解，從而影響HSPG的表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)展。本研究旨在探討miRNA-145對膀胱癌細(xì)胞中syndecan-2的調(diào)控作用及對細(xì)胞增殖、分化的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑與儀器人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株T24購自蓋寧生物公司。轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體RNAi-MAX、miRNA-145前體購自美國Thermo Fisher Scientific公司，總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根公司，熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，引物和syndecan-2 siRNA由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自美國Promega公司，細(xì)胞衰老檢測試劑盒購自美國Abnova公司，凋亡檢測試劑盒購自美國Millipore公司。ABI 7500全自動(dòng)熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，Nikon50i顯微鏡圖文系統(tǒng)(日本Nikon公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)T24細(xì)胞培養(yǎng)于無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，添加含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清和青鏈霉素雙抗，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3轉(zhuǎn)染miRNA-145對T24細(xì)胞增殖、分化的影響(實(shí)驗(yàn)Ⅰ)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 T24細(xì)胞分為2組，空白對照組不處理；轉(zhuǎn)染miRNA-145組根據(jù)轉(zhuǎn)染說明書，使用脂質(zhì)體RNAi-MAX轉(zhuǎn)染，加入miRNA-145前體，以提高miRNA-145的表達(dá)。

1.3.2 細(xì)胞增殖檢測 轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，采用MTT法檢測2組細(xì)胞492 nm處的吸光度并在鏡下觀察細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，下同。

1.3.3 細(xì)胞中syndecan-2及多種細(xì)胞分化標(biāo)志物mRNA表達(dá)的檢測 轉(zhuǎn)染72 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；采用熒光定量PCR檢測2組細(xì)胞中syndecan-2，鱗狀細(xì)胞標(biāo)志物(P63、TP73和CK5)，腺狀細(xì)胞標(biāo)志物(MUC-1、MUC-3)，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)志物(NSE、UCHL-1、CGA)，干細(xì)胞標(biāo)志物(NANOG、OCT3、 SOX2和 E2F4)mRNA的表達(dá)。引物序列見表1。用RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80 ℃保存。反應(yīng)體系:cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL, ROX Reference Dye(50×)0.1 μL，SYBR Premix Ex Taq(2×)(Til RNaseH Plus)10 μL, dH2O 7.1 μL。循環(huán)參數(shù):95 ℃30 s;95 ℃5 s, 60 ℃34 s, 共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的mRNA的相對表達(dá)量。

表1 基因引物序列

1.4轉(zhuǎn)染syndecan-2siRNA對T24細(xì)胞衰老、凋亡及分化的影響(實(shí)驗(yàn)Ⅱ)

1.4.1 細(xì)胞分組 T24細(xì)胞分為2組，空白對照組不處理；轉(zhuǎn)染syndecan-2 siRNA組參考1.3.1中轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染100 ng/L syndecan-2 siRNA。syndecan-2 siRNA序列是5’-GAAGACTGCTCCGGACCTAGC-3’。

1.4.2 細(xì)胞衰老和凋亡檢測 ①采用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶法檢測細(xì)胞衰老，按照細(xì)胞衰老檢測試劑盒說明書操作。轉(zhuǎn)染72 h后，吸取2組細(xì)胞各1 mL，用PBS洗滌3次后棄上清，按照細(xì)胞衰老檢測試劑盒說明書，加入染色固定液，室溫固定15 min后用PBS漂洗3次，棄上清，加入染色工作液，37 ℃孵育過夜。顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)高倍鏡下100個(gè)細(xì)胞中藍(lán)染細(xì)胞(衰老細(xì)胞)個(gè)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞衰老率。②采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作。轉(zhuǎn)染72 h，收集2組細(xì)胞制備細(xì)胞涂片，室溫固定20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，加封閉液，再漂洗，浸入細(xì)胞膜通透液，漂洗后進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，最后DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，整個(gè)實(shí)驗(yàn)在避光條件下進(jìn)行。計(jì)數(shù)高倍鏡下100個(gè)細(xì)胞中染成棕色的細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)個(gè)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4.3 細(xì)胞中syndecan-2及細(xì)胞分化標(biāo)志物mRNA表達(dá)的檢測 轉(zhuǎn)染72 h后，參照1.3.3方法檢測2組細(xì)胞中syndecan-2及MUC-1、TP73、NANOG、NSE mRNA的表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。采用2×3析因設(shè)計(jì)的方差分析比較實(shí)驗(yàn)Ⅰ2組細(xì)胞增殖能力的差異，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)Ⅰ和實(shí)驗(yàn)Ⅱ轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與空白對照組其他指標(biāo)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)Ⅰ2組細(xì)胞增殖檢測隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，2組細(xì)胞吸光度升高；與空白對照組比較，轉(zhuǎn)染miRNA-145組吸光度降低(表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)Ⅰ細(xì)胞增殖情況比較

F組間=34.105，P<0.001；F時(shí)間=46.834，P<0.001；F交互=8.562，P<0.001

2.2實(shí)驗(yàn)Ⅰ2組細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及細(xì)胞分化標(biāo)志物、干細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)的比較與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-145組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染72 h后出現(xiàn)類似腺狀細(xì)胞的膨脹細(xì)胞質(zhì)及類似神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的細(xì)長軸突(圖1)；同時(shí)，鱗狀細(xì)胞標(biāo)志物(P63、TP73和CK5)，腺狀細(xì)胞標(biāo)志物(MUC-1、MUC-3)，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)志物(NSE、UCHL-1、CGA)及干細(xì)胞標(biāo)志物(NANOG、OCT3、SOX2和 E2F4)mRNA的表達(dá)均增加(表3、4)?？瞻讓φ战M和轉(zhuǎn)染miRNA-145組syndecan-2 mRNA的表達(dá)水平分別為(1.00±0.19)和(0.52±0.16)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.347,P=0.029)。

A:空白對照組；B:轉(zhuǎn)染miRNA-145組腺狀細(xì)胞樣改變；C：轉(zhuǎn)染miRNA-145組神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞樣改變

組別鱗狀細(xì)胞標(biāo)志物TP73P63CK5腺狀細(xì)胞標(biāo)志物MUC-1MUC-3神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)志物NSEUCHL-1CGA空白對照組1.00±0.121.00±0.321.00±0.541.00±0.891.00±0.191.00±0.661.00±0.281.00±0.16轉(zhuǎn)染miRNA-145組1.65±0.182.03±0.285.87±1.084.73±1.151.94±0.292.59±0.381.94±0.351.67±0.33t5.2044.1966.9864.4434.6963.6163.6323.164P0.0060.0140.0020.0110.0090.0220.0210.034

表4 實(shí)驗(yàn)Ⅰ轉(zhuǎn)染72 h后 干細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)的比較(n=3)

2.3實(shí)驗(yàn)Ⅱ2組細(xì)胞syndecan-2表達(dá)的比較空白對照組和轉(zhuǎn)染syndecan-2 siRNA組syndecan-2 mRNA的表達(dá)水平分別為(1.00±0.05)和(0.49±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.796,P<0.001)。

2.4實(shí)驗(yàn)Ⅱ2組細(xì)胞衰老和凋亡情況轉(zhuǎn)染72 h后，與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染syndecan-2 siRNA組衰老細(xì)胞增多，見圖2、表5。

A:細(xì)胞衰老;B:細(xì)胞凋亡;1:空白對照組;2:轉(zhuǎn)染syndecan-2 siRNA組

2.5實(shí)驗(yàn)Ⅱ2組細(xì)胞分化標(biāo)志物和NANOGmRNA表達(dá)的比較轉(zhuǎn)染syndecan-2 siRNA組細(xì)胞主要分化標(biāo)志物和干細(xì)胞分化標(biāo)志物NANOG mRNA的表達(dá)增加(表6)。

表6 實(shí)驗(yàn)Ⅱ2組細(xì)胞 分化標(biāo)志物mRNA表達(dá)的比較(n=3)

3 討論

膀胱癌占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率和死亡率的第一位，深入研究膀胱癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的標(biāo)志物，有助于加深對該病的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也能為尋找新的治療手段提供理論依據(jù)[8]。

miRNA-145是miRNA中的一種，位于人5號(hào)染色體長臂的3區(qū)2帶(5q32)[9]，它在結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌和食管癌中的表達(dá)降低[10-15]，可能是一種腫瘤抑制物。有研究[16]表明miRNA-145可通過抑制某個(gè)靶點(diǎn)而抑制原癌基因的激活，而原癌基因被激活后也可抑制miRNA-145的表達(dá)，使其不能發(fā)揮正常功能。miRNA-145能夠抑制多種癌基因表達(dá)從而抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，在肺腺癌中抑制表皮生長因子和NUDT1[17]，在食管鱗狀細(xì)胞癌中抑制Fascin-1[18]、在肝癌中抑制胰島素樣生長因子[19]。該研究結(jié)果顯示上調(diào)miRNA-145后T24細(xì)胞增殖能力減弱，說明其在膀胱癌增殖、發(fā)展中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，這與之前的研究結(jié)果一致。此外，研究結(jié)果還顯示， miRNA-145能使T24細(xì)胞分化為具有干細(xì)胞特征的多能細(xì)胞，這也印證了前人關(guān)于miRNA有將癌細(xì)胞重新誘導(dǎo)為干細(xì)胞樣細(xì)胞的潛能的報(bào)道[20]。

此外，本研究結(jié)果顯示上調(diào)miRNA-145后T24細(xì)胞中syndecan-2表達(dá)下降。syndecan-2是一種跨膜蛋白多糖，是HSPG家族中的一員，其核心蛋白部位的多功能區(qū)與糖胺聚糖鏈的胞外配體及胞膜受體相結(jié)合，介導(dǎo)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)，與腫瘤的分化、發(fā)展密切相關(guān)[21]。syndecan-2從腫瘤細(xì)胞表面脫落，其N端的亮氨酸殘基可被MMP-7剪切[22]，脫落在培養(yǎng)基或基質(zhì)中的胞外段能提高癌細(xì)胞黏附和侵襲能力。有研究[23]表明syndecan-2在結(jié)腸癌細(xì)胞株中處于高表達(dá)狀態(tài)，蛋白表達(dá)越高，癌細(xì)胞侵襲力越強(qiáng)。另有研究[24]顯示syndecan-2對于腫瘤發(fā)生和前列腺腫瘤干細(xì)胞的再生至關(guān)重要。在乳腺癌中miRNA-145能夠調(diào)控syndecan-2的表達(dá)，影響乳腺癌細(xì)胞的遷移[25]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA建立穩(wěn)定沉默syndecan-2的細(xì)胞株后，細(xì)胞主要分化標(biāo)志物和NANOG mRNA的表達(dá)增加，細(xì)胞發(fā)生衰老，說明下調(diào)syndecan-2的表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和分化。

綜上所述，在膀胱癌T24細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染miRNA-145，可下調(diào)syndecan-2表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和分化，從而抑制腫瘤增殖。