郭亮亮，劉澤員，張靜

(鄭州大學(xué) 化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001)

殼聚糖價廉易得，且具有止血、抑菌、抗癌等多種生理功能，且無毒、無刺激、可自然降解[1]，這使得殼聚糖得以被廣泛應(yīng)用。在腫瘤治療[2-3]、組織工程[4-6]、藥物遞送[7-10]、水處理[11-13]、食品包裝[14-16]等方面，殼聚糖均有被研究及應(yīng)用；此外殼聚糖在其它方面[17]也有應(yīng)用。

由于優(yōu)異的止血性能，殼聚糖類止血材料成為近幾年止血材料的研究熱點之一。有研究表明，殼聚糖某些衍生物在水溶性、止血性等方面優(yōu)于殼聚糖。將殼聚糖特定衍生物制成微球，可提高其比表面積等參數(shù)。本文綜述殼聚糖復(fù)合微球的幾種制備方法及其在止血、抗癌、藥物遞送、藥物緩釋方面的應(yīng)用。

1 殼聚糖復(fù)合微球制備方法

1.1 反相乳化法

反相乳化法是乳化法中的一種，常與其它方法結(jié)合使用。反相乳化法是指以殼聚糖溶液為分散相，液體石蠟、石油醚等為連續(xù)油相，配制成油包水(W/O)的殼聚糖乳劑，再根據(jù)要求加入定量戊二醛等交聯(lián)劑或通過其它方式進(jìn)行固化，分離干燥得到殼聚糖微球。其中戊二醛與殼聚糖交聯(lián)的反應(yīng)機(jī)理見圖1[18]。

薛海燕等[19]應(yīng)用該方法制備出了以殼聚糖和丙烯酸為主要基材的改性殼聚糖復(fù)合微球，復(fù)合微球的力學(xué)性能、規(guī)整程度受到基材比例、攪拌速率、反應(yīng)溫度、中和度、水油比、乳化劑用量以及乳化時間等因素的影響，后續(xù)的花青素吸附實驗[20]中，在優(yōu)化后的條件下，吸附率可達(dá)95.60%，這表明了復(fù)合微球?qū)ㄇ嗨匚降目尚行?。反相乳化法的?yōu)點是毋庸置疑的，例如所包裹的藥物不受親水性、親油性限制，反應(yīng)條件、操作流程簡單易行且所制備的微球外形規(guī)整、大小均一，但其也有一定的不足之處，比如反應(yīng)所需的交聯(lián)劑大都有一定毒性，此外交聯(lián)劑還會致使某些藥物失去活性。因此低毒性交聯(lián)劑成為了研究人員的關(guān)注點。

圖1 戊二醛與殼聚糖交聯(lián)的反應(yīng)機(jī)理Fig.1 Reaction mechanism of cross-linking of glutaraldehyde with chitosan

1.2 離子交聯(lián)法

離子交聯(lián)法是指根據(jù)殼聚糖在酸性條件下表面帶有正電荷，而一些聚離子如三聚磷酸鈉帶負(fù)電荷的特性，控制適當(dāng)條件，使得二者通過分子間的靜電作用相互交聯(lián)形成網(wǎng)狀或體形而生成殼聚糖微球的方法。三聚磷酸鈉與殼聚糖交聯(lián)的原理圖見圖2。

圖2 三聚磷酸鈉與殼聚糖交聯(lián)的原理圖Fig.2 Schematic diagram of cross-linking of sodium tripolyphosphate and chitosan

Tan等[21]結(jié)合離子交聯(lián)法和噴霧干燥法，制備了負(fù)載有阿莫西林的納米殼聚糖微球，微球中的殼聚糖與阿莫西林相互作用，顯著增強(qiáng)了后者的抗菌性，復(fù)合微球的MIC值比阿莫西林低3倍。該方法所需反應(yīng)條件溫和，操作簡單。其最大優(yōu)點在于避免了有毒副作用的交聯(lián)劑的使用，用于藥物包裹等醫(yī)藥領(lǐng)域時，能夠最大限度保留藥物活性甚至一定程度上起到增強(qiáng)作用。但此方法制得的微球機(jī)械強(qiáng)度較差，規(guī)整程度有待提高。

1.3 噴霧干燥法

噴霧干燥法是指通過一種霧化器，將液體物料霧化成小液滴，混入熱風(fēng)中，使液滴中的溶劑瞬間揮發(fā)進(jìn)而形成微球的方法。Mishra等[22]結(jié)合離子交聯(lián)與噴霧干燥兩種方法，制備出包封兩種抗生素(鹽酸多西環(huán)素、左氧氟沙星鹽酸鹽)的殼聚糖聚電解質(zhì)復(fù)合物微粒，該微粒緩釋效果優(yōu)良、靶向效率高且沒有明顯細(xì)胞毒性。通過噴霧干燥制備的殼聚糖聚電解質(zhì)復(fù)合物微粒適合作為替代載體，用于吸入類藥物來遞送抗生素。該方法要求熱風(fēng)不與液體物料反應(yīng)，對于熱敏型物料不適用。該方法中的原料液濃度、氣流速度、進(jìn)口氣流溫度均對產(chǎn)品質(zhì)量有影響。噴霧干燥是目前最適合大規(guī)模生產(chǎn)的一種方法，應(yīng)用前景廣泛。

1.4 凝聚法

由于殼聚糖單體環(huán)上存在氨基基團(tuán)且其在酸性條件下易發(fā)生質(zhì)子化，這使得殼聚糖表面存在正電荷而溶于弱酸。凝聚法就是利用這個特點，通過降低殼聚糖在溶液中的溶解度，析出沉淀進(jìn)而來制備微球。復(fù)凝聚法是凝聚法中的一種，適合用于制備親水性藥物微球。單凝聚法與復(fù)凝聚法的區(qū)別在于，單凝聚法是利用物理或化學(xué)等手段降低殼聚糖溶解度而將其析出來制備微球，而復(fù)凝聚法是利用另一種帶有負(fù)電荷的高分子材料與殼聚糖相互交聯(lián)共同沉淀制備微球。Kim等[23]通過含有陰離子的黃原膠與含有陽離子的殼聚糖相互凝聚，制備了殼聚糖-黃原膠微球，該微球體外釋放為非Fickian擴(kuò)散，對人真皮層纖維細(xì)胞無毒性且對牙齦卟啉單胞菌生長有選擇性抗菌作用，動物模型試驗有待進(jìn)一步進(jìn)行。凝聚法具有一定的優(yōu)勢，在反應(yīng)過程中不需要使用額外的溶劑，避免了溶劑殘留可能造成的毒性；但其仍有不足之處，包封率低、釋放速率快等問題有待解決[24]。

2 殼聚糖復(fù)合微球制備及應(yīng)用

2.1 止血方面

血液凝固的“瀑布學(xué)說”由MacFarlane、Davies和Ratnoff于1964年提出，該學(xué)說將血液凝固過程大致分為凝血酶原激活物形成、凝血酶形成、纖維蛋白形成三個階段，被廣泛認(rèn)同[25]。目前使用的止血藥物也都是通過激發(fā)血液凝固瀑布機(jī)制中某一環(huán)節(jié)[26]。殼聚糖止血大致分為三種方式：①殼聚糖本身的陽離子特性以及其本身結(jié)構(gòu)和分子量，可使得紅細(xì)胞大量吸附紅細(xì)胞而止血；②殼聚糖的正電特性刺激血小板，后者活化后不僅能迅速在殼聚糖表面聚集形成血凝塊，而且進(jìn)一步發(fā)生凝聚，使凝塊更牢固；③殼聚糖由于其本身獨特的分子結(jié)構(gòu)，能通過在體內(nèi)的一系列生化反應(yīng)后，結(jié)合幾乎所有的主要血漿蛋白，及一些重要的凝血因子,從而起到進(jìn)一步牢固血凝塊的作用[27]。近年來殼聚糖在止血方面的應(yīng)用研究發(fā)展迅猛。

Li等[28]把反相乳化法與熱致相分離法結(jié)合起來，以殼聚糖的醋酸溶液為分散相，石油醚為連續(xù)相，司盤80和吐溫60為表面活性劑，NaOH、乙醇的水溶液為相轉(zhuǎn)化液，制得多孔殼聚糖微球。該微球的表面積、孔隙率、吸水率分別為28.2～31.5 m2/g、 98%、15.5～23.2 g/g，表面孔徑在2.0 μm以下。大鼠肝切口模型實驗表明，多孔殼聚糖微球與普通殼聚糖微球相比，止血時間大大縮短，失血量顯著降低。組織學(xué)測試表明，在肝臟裂傷的應(yīng)用中，多孔殼聚糖微球具有良好的生物相容性及生物活性。

Sun等[29]同樣結(jié)合反相乳化和熱致相分離兩種方法，在殼聚糖溶液中加入高嶺土，司盤80為乳化劑，乙醇為反相溶液，其它步驟與制備多孔殼聚糖微球相同，制備出殼聚糖/高嶺土多孔復(fù)合微球。與純殼聚糖多孔微球相比，殼聚糖/高嶺土多孔復(fù)合微球在大鼠尾截肢和肝裂傷模型中的止血時間均有明顯降低。全凝血動力學(xué)表明，在相同時間內(nèi)，與純殼聚糖多孔微球、市售celox止血王(速效止血粉)相比，多孔復(fù)合微球所形成的血塊更大。其研究結(jié)果表明，多孔復(fù)合微球有作為快速止血劑，用于創(chuàng)傷止血的巨大潛力。

Pan等[30]以Li、Sun等的研究為基礎(chǔ)，在制備多孔殼聚糖微球的過程中，向乳液中添加含有β-(1，4)-甘露糖醛酸酯(M)和α-L-古洛糖醛酸酯(G)單元嵌段的陰離子天然聚合物(SA)溶液、ZnCl2溶液，制備出了含鋅離子的多孔殼聚糖微球。與純殼聚糖多孔微球相比，在大鼠肝裂傷和尾切除模型中，CS@ZnAlg微球的血液凝塊更大、凝血時間更短、出血量更短。孫雙等[31]采用離子交聯(lián)法，將葉酸與月桂酸鈉的二甲基亞砜共溶液加入到O-羧甲基殼聚糖的醋酸-醋酸鈉緩沖液溶液中進(jìn)行反應(yīng)，獲得葉酸-O-羧甲基殼聚糖 (FA-O-CMCS)復(fù)合微球。經(jīng)檢測，該微球結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，粒徑在0.9～1 μm，比較均勻。最后采用斷尾取血法探究FA-O-CMCS復(fù)合微球的凝血、止血性能，結(jié)果顯示，凝血、止血時間分別為139 s和266 s，效果顯著。

2.2 藥物載體方面

殼聚糖安全無毒、可降解、生物相容性良好，是一種天然聚陽離子多糖，可根據(jù)其具有正電荷這一特性將其制備成微球，并負(fù)載或者包裹目標(biāo)藥物，用于止血、疾病治療等方面。近年來，殼聚糖微球作為藥物載體一直是人們的研究熱點。

2.2.1 抗癌 殼聚糖抗癌有兩種形式：第一，殼聚糖本身具有抗癌活性；第二，殼聚糖作為藥物載體負(fù)載或包裹抗癌藥物實現(xiàn)抗癌。對于第一種形式，殼聚糖可通過直接作用于腫瘤細(xì)胞，抑制其生長，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能三種途徑實現(xiàn)抗癌作用[32]。對于第二種形式，殼聚糖經(jīng)常被用于包裹或負(fù)載抗癌活性藥物實現(xiàn)抗癌，近年來研究較多。

Anitha等[33]首先將殼聚糖制備成N,O-羧甲基殼聚糖(N，O-CMC)，隨后通過離子交聯(lián)法，在恒速攪拌下將離子交聯(lián)劑三聚磷酸鈉(TPP)加入到N，O-CMC溶液中，首先制得N，O-CMC納米微粒。進(jìn)一步地，在連續(xù)攪拌條件下，向N，O-CMC溶液中逐滴加入姜黃素的乙醇溶液，之后再加入TPP，得到負(fù)載姜黃素的納米N,O-羧甲基殼聚糖微粒。這些微球平均直徑(150±30)nm分布，為球形狀態(tài)，MTT測試表明，該微球?qū)φ＜?xì)胞無毒，并對癌細(xì)胞有特異毒性。同年Anitha等[34]還開發(fā)了負(fù)載5-氟尿嘧啶的N，O-羧甲基殼聚糖納米顆粒，并進(jìn)行了抗癌活性研究，與常規(guī)化療相比，該顆粒不僅顯示出了乳腺癌細(xì)胞的毒性，而且副作用很低，血液相容性良好，藥物包封率達(dá)65%。

殷啟風(fēng)等[35]也利用該方法，制備出包裹C-藻藍(lán)蛋白的納米微球(C-PC/CMC-NPs)。該納米微球形狀規(guī)整，平均粒徑為120 nm。進(jìn)一步地，他們又在C-PC/CMC-NPs上負(fù)載CD59sp(CD59 配體)，從而制備出羧甲基殼聚糖包裹C-藻藍(lán)蛋白負(fù)載CD59 配體的靶向納米微球(C-PC/CMC-CD59sp-NPs)。MTT測試表明，該微球在體外對HeLa 細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，具有良好的靶向性。在適宜pH條件下，120 h內(nèi)釋放率可達(dá)80%，并且無溶血現(xiàn)象發(fā)生。

Sriram等[36]通過離子交聯(lián)法制備出負(fù)載有CuO-姜黃素的殼聚糖-苯丙酮復(fù)合載藥微球，該微球的藥物釋放遵循非Fickian定律。由于殼聚糖中的芳基酮以及親水性納米CuO的存在，姜黃素得以有效釋放。他們研究了所制備微球?qū)19-MEL、MCF-7和HeLa的抗癌活性，結(jié)果顯示復(fù)合微球的抗癌活性與游離苯丙酮相當(dāng)，其IC50值為12～19 μg/mL，抗癌活性顯著。

2.2.2 藥物遞送 藥物遞送系統(tǒng)系采用多學(xué)科的手段將藥物有效地遞送到目的部位，與傳統(tǒng)制劑相比，其可以提高藥物穩(wěn)定性，減輕藥物毒副作用，提高藥物利用率，在靶向區(qū)維持所需藥物濃度，目前已發(fā)展建立了多種類型的新型藥物遞送系統(tǒng)[37]。

Yan等[9]以三價鋁離子為交聯(lián)劑，使用離子交聯(lián)法制備了羧甲基殼聚糖/聚谷氨酸復(fù)合微粒(CMCS/PGA)，性能測試結(jié)果表明，CMCS/PGA復(fù)合微粒的溶脹性能對pH值敏感，CMCS微球的親水性隨著PGA的引入大大提高。隨后的研究中，又將親水性藥物左氧氟沙星(LFX)封裝為模型藥物以測試CMCS/PGA復(fù)合微粒的包封性能和體外釋放性能，結(jié)果表明，CMCS/PGA復(fù)合微粒的體外釋放性優(yōu)異，持續(xù)給藥，包封率達(dá)到28.6%，是理想的藥物遞送載體。

王大衛(wèi)等[38]采用噴霧干燥法，以殼聚糖及兩種提取物原花青素、白芨多糖為原料，制備出了原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球。經(jīng)一系列表征得，粒徑分布在2～15 μm之間，形狀規(guī)整，有良好的溶脹特性，具有緩釋作用，有望成為肺吸入給藥的良好載體。

李納等[39]將離子交聯(lián)法與噴霧干燥法結(jié)合起來，首先制備出姜黃素磷脂復(fù)合物(Cur-PS)水分散液，再將殼聚糖的醋酸溶液與之混合均勻，在攪拌條件下將三聚磷酸鈉逐滴加入到混合液中，靜置后經(jīng)噴霧干燥制得姜黃素磷脂復(fù)合物殼聚糖微球。該微球呈表面光滑的完整球形，平均粒徑可低至(5.19±0.4)μm，有望用于肺部給藥。

2.2.3 藥物緩釋 在日常傷口處理以及臨床給藥方面，時常會有持續(xù)給藥的要求，多次給藥會造成病人痛苦，增加成本。緩釋藥物能有效減少給藥次數(shù)，控制藥物釋放速率，延長藥物作用時間，維持有效的藥物濃度，降低藥物的毒副作用[40]，增加病人的順應(yīng)性。殼聚糖理化性質(zhì)優(yōu)良，可被制成藥物載體用于藥物緩釋。Webber等[41]將殼聚糖添加到醋酸溶液中，攪拌至溶解，加入蒸餾水稀釋后將其加入到還原型谷胱甘肽(GSH)的水溶液中，調(diào)節(jié)相關(guān)參數(shù)，經(jīng)噴霧干燥器制得包裹有GSH的殼聚糖微球，該微球表面光滑，具有一定的緩釋性能。

Helbling等[42]結(jié)合離子交聯(lián)法和噴霧干燥法，將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的黃體酮分散到殼聚糖的醋酸溶液，并加入合適量的乳化劑吐溫80，攪拌均化，將交聯(lián)劑三聚磷酸鈉(TPP)逐滴加到均化后的溶液中，調(diào)節(jié)干燥器的進(jìn)口溫度、液體流量、干燥空氣流量等參數(shù)，經(jīng)噴霧干燥制得包裹黃體酮的殼聚糖微粒。經(jīng)過測試，所制備的復(fù)合殼聚糖微球平均粒徑分布在1～7 μm之間。復(fù)合殼聚糖微球的球形度隨著乳化劑用量的增加而增加，隨著交聯(lián)劑的增加而減小，對黃體酮的包封率在69%～75%之間。在中性的緩沖溶液中，黃體酮持續(xù)釋放，這為黃體酮在人體內(nèi)的持續(xù)給藥提供了可能。

Unagolla等[7]應(yīng)用凝聚法，首先配制低分子量殼聚糖的乙酸溶液，過濾后加入萬古霉素溶液并攪拌，完全溶解后將混合溶液滴加到三聚磷酸鈉溶液中，以一定速度攪拌2 h，過濾后室溫下風(fēng)干過夜制備出包裹萬古霉素的殼聚糖微球。同時，他們用該方法制備了包裹萬古霉素的殼聚糖-藻酸鹽微球。首先，配制殼聚糖、氯化鈣的共溶液，加入萬古霉素溶液并攪拌，連續(xù)攪拌下將共混液逐滴加入海藻酸鹽/TPP溶液中，一段時間后將所得顆粒于室溫風(fēng)干過夜。經(jīng)表征測試得，微球表面粗糙，均勻分布。其中，經(jīng)凍干獲得的萬古霉素的殼聚糖-藻酸鹽微球具有最優(yōu)良的控釋性能，該微球平均每天釋放萬古霉素22 μg，且持續(xù)長達(dá)14 d。萬古霉素的釋放速率并未隨藻酸鹽濃度增加而增加。

Xin等[43]首先將明膠與海藻酸鈉水溶液均勻混合，加入定量大蒜素油，均質(zhì)后將乳化液逐滴加入到氯化鈣溶液中，隨后將所得微球加入到殼聚糖溶液中，可得大蒜素/海藻酸鈉/明膠/殼聚糖復(fù)合微球。經(jīng)測試表征，微球粒徑在0.8～0.9 mm 之間分布，形狀規(guī)則，對pH敏感，具有良好緩釋性能，且明膠的加入可延長藥物緩釋時間。

Scalera等[10]配制不同濃度殼聚糖溶液并加入聚山梨酯80作為表面活性劑，將過濾后的氫氧化鈉溶液逐滴加入到殼聚糖溶液中，得到殼聚糖微球。該微球平均直徑在150～400 nm范圍內(nèi)，其中最小的微球在水溶液中能夠穩(wěn)定存在3 d，說明該微球可用于短時間藥物遞送。

3 展望

近年來殼聚糖因其優(yōu)異的特性、低廉的價格已得到廣泛研究，在生物、醫(yī)學(xué)、水處理、食品包裝等諸多領(lǐng)域均有應(yīng)用，但進(jìn)一步的精細(xì)研究必不可少。新型止血材料的研究日漸增多，發(fā)展迅速，市場上已存在各種劑型的止血材料，但一些不足之處例如經(jīng)濟(jì)性、生物相容性、持久性、應(yīng)用范圍受限等依然存在，尤其是不可擠壓止血的體內(nèi)大面積出血，目前仍沒有有效的止血材料可以解決此類問題，這都是我們努力的方向。殼聚糖微球近幾年成為止血材料的研究熱點，多孔殼聚糖微球、殼聚糖復(fù)合止血微球因其優(yōu)良性能脫穎而出。然而對于這類材料來說，只擁有止血、無毒這些性能是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，優(yōu)良的降解性能也是止血材料所必備的特性。此外，止血材料不僅不能引起炎癥等不良反應(yīng)的發(fā)生，而且在止血的同時，其本身也應(yīng)具備抗菌性，防止感染的發(fā)生。再者有些傷口如燒傷創(chuàng)面的愈合是無法在短時間內(nèi)完成的，這就要求止血材料具有長效止血、長效抑菌的特性。所以將可降解、具有更強(qiáng)止血性能的殼聚糖衍生物制備成緩釋微球?qū)⑹墙窈笾寡牧系陌l(fā)展方向。