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        Bcl-2改善老年人骨髓間充質(zhì)干細胞抗缺氧損傷能力的研究

        2019-04-02 02:33:00張東旸蔣樹林
        心肺血管病雜志 2019年2期
        關(guān)鍵詞:充質(zhì)存活自體

        陳 巍 張東旸 白 龍 范 明 蔣樹林 田 海

        既往研究已經(jīng)證實,骨髓間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)能有效改善心肌梗死后的心臟功能[1-2]。然而,近年來在臨床研究中應(yīng)用自體hMSCs移植治療心肌梗死的效果卻不理想。前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)臨床心肌梗死患者多為老年人并進一步證實了自體干細胞移植治療心肌梗死效果不佳的主要原因與供體年齡相關(guān),老年人hMSCs移植后的大量死亡可能影響了治療效果[3]。為進一步探索改善老年人hMSCs治療心肌梗死效果的方法,本次研究將B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)轉(zhuǎn)染至老年hMSCs,以期增強老年hMSCs移植后的在心肌梗死心臟的存活能力,觀察能否增強老年hMSCs移植治療心肌梗死的效果。

        材料與方法

        1.材料 研究開始前我院倫理委員會討論并通過了本實驗中人類骨髓的獲取及研究,骨髓來源于我院心臟外科手術(shù)患者,取材前詳細告知患者或其家屬骨髓取材過程及用途,并簽訂知情同意書,老年人骨髓來自于50~70歲心臟瓣膜病患者,有發(fā)紺、肝炎、梅毒、嚴重器官功能障礙或肺動脈高壓的患者均被排除在供體選擇之外。大鼠由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物實驗中心提供,選擇12周齡清潔級雌性Wistar大鼠,體質(zhì)量200~250g。轉(zhuǎn)染用重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP/Bcl-2購于上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司,Inspira小動物呼吸機廠商為Harvard Apparatus。

        2.方法 (1)老年人hMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 心外科手術(shù)正中開胸前,于胸骨抽取5 mL骨髓并加入等量的PBS后充分混勻,于離心管中加入與骨髓和PBS混合液等量的Ficoll離心液,并按1∶1的比例小心加入骨髓與PBS的混合液,以400倍重力,4℃條件下離心20min后,取中間白色單核細胞層接種到培養(yǎng)瓶中,用含10%胎牛血清和抗生素的IMDM培養(yǎng)基在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)液,此后每隔2~3 d換一次培養(yǎng)液至細胞80%匯合時,應(yīng)用胰酶消化法(0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA)消化和傳代。第3代細胞使用流式細胞儀進行鑒定,CD29、CD90、CD105陽性而CD34、CD45、CD133陰性的即為目的細胞。

        (2)Bcl-2轉(zhuǎn)染老年hMSCs及鑒定 應(yīng)用上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供Bcl-2質(zhì)粒進行擴增和提取后,按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書步驟將Bcl-2基因轉(zhuǎn)染至老年hMSCs,利用綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)染后48 h在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染情況并應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞轉(zhuǎn)染效率。

        3.體外缺氧培養(yǎng)模型的建立 用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液將轉(zhuǎn)染前后的老年hMSCs配成單個細胞懸液,每組細胞每次測量共設(shè)3個復(fù)孔,以5 000個/孔的密度鋪于事先置于24孔板中的細胞載玻片上,每孔100μL的10%胎小牛血清IMDM在含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,各孔更換無血清IMDM培養(yǎng)液至終體積500μL,置于用含5%CO2和95%N2的混合氣體調(diào)整氧濃度至2%的37℃缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

        (4)缺氧培養(yǎng)后各組細胞凋亡的檢測 將轉(zhuǎn)染前后的老年hMSCs經(jīng)過缺氧培養(yǎng)后,按照試劑盒說明書步驟應(yīng)用Annexin V/PI雙染色法測定各組細胞缺氧前后早期凋亡情況并進行對比。

        (5)大鼠心肌梗死模型的制備 Wistar大鼠,6~8周齡,(250±20)g,按體質(zhì)量給予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉,16G靜脈留置針氣管插管,小動物呼吸機輔助呼吸,以心尖搏動最強點為中心,沿第四肋間做橫行切口,約2~3 cm,依次切開皮膚、筋膜及肋間肌肉,以自制肋間拉鉤暴露術(shù)野,撕開心包,結(jié)扎點在肺動脈圓錐和心尖連線上,于左心耳下方1~2mm處進針,方向與左心耳的邊緣平行,進針深度約1.5mm,結(jié)扎時可見冠脈遠端心肌變白,室壁運動明顯減弱,冠狀動脈結(jié)扎后15 min,將轉(zhuǎn)染前后老年hMSCs 2×106個細胞與同等體積培養(yǎng)基混合后注射到在缺血區(qū)和正常心肌交界區(qū)域,共選擇3點,每點約40μL,關(guān)胸后每日觀察大鼠情況。

        (6)各組細胞移植后的存活檢測 術(shù)后四周大鼠腹腔注射9 mL/kg的10%水合氯醛,麻醉過量致死,迅速開胸,阻斷主動脈遠端,于近端灌注4℃心臟停跳液約5 mL,至心臟停跳,取下心臟置于4%多聚甲醛中固定48 h,95%乙醇脫水,常規(guī)石蠟包埋。切片應(yīng)由心尖至心底按短軸平面連續(xù)切片,保證心尖、心底和心肌梗死區(qū)域都能切到,每張切片厚度約5μm。組織切片經(jīng)人線粒體染色后存活細胞呈棕色,每只實驗動物隨機選取3張切片,每張切片選取5個放大200倍視野進行觀察,計數(shù)每個視野內(nèi)陽性染色的細胞數(shù),從而計算各組細胞移植后的存活數(shù)量。

        (7)各組細胞移植后心功能的檢測 設(shè)定單純心肌梗死大鼠模型為對照組,以及老年細胞移植組和Bcl-2轉(zhuǎn)染后老年細胞移植組。實驗大鼠在梗死模型建立前、梗死模型建立后1周、2周和4周行心臟超聲測量心功能。大鼠以3 mL/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,胸部剪毛,置仰臥位。11.5MHz探頭檢測對照組及各組細胞移植后不同時間點的EF并進行對比分析。

        3.統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS19軟件進行統(tǒng)計分析。所有計量數(shù)據(jù)都采用均值±標準差表示,比較分析采用t檢驗,采用重復(fù)測量方差比較分析超聲心動圖檢測各組細胞移植后心功能情況。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1.老年hMSCs的培養(yǎng)、鑒定及轉(zhuǎn)染 按前述方法在術(shù)中獲得的骨髓經(jīng)分離培養(yǎng)至第3代時,所獲細胞形態(tài)呈間充質(zhì)干細胞的長梭型、成旋渦狀或放射狀排列,經(jīng)流式細胞儀測定穩(wěn)定表達表面抗原CD29、CD90、CD105,不表達其他干細胞細胞表面抗原CD34、CD45、CD133,轉(zhuǎn)染Bcl-2基因后能夠穩(wěn)定表達所帶綠色熒光蛋白,經(jīng)流式細胞儀檢測細胞轉(zhuǎn)染效率為11.5%(圖1)。

        2.缺氧培養(yǎng)后的細胞凋亡情況 按前述方法進行Anexin V/PI雙染后通過流式細胞儀檢測,可見缺氧前轉(zhuǎn)染前后O-MSC(the old mesenchymal stem cells)的早期凋亡幾乎沒有,而缺氧后兩組細胞的早期凋亡細胞數(shù)均有增多,且O-MSC組的早期凋亡細胞數(shù)較多(圖2~4)。

        3.移植后的細胞存活情況 兩組O-MSC移植術(shù)后四周,大鼠心臟切片經(jīng)人線粒體特異染色結(jié)果可見O-MSC+Bcl-兩組沿注射路徑分布的移植細胞呈圓形、被染成棕黃色,而O-MSC組中幾乎見不到存活的移植細胞(圖5~6)。

        4.移植后的心功能 超聲心動圖結(jié)果所示術(shù)前各組間射血分數(shù)無差別,術(shù)后不論是一周、兩周還是四周,O-MSC+Bcl-兩組的射血分數(shù)與兩外兩組相比均有差異,對照組和O-MSC組相比未見到差異,因此移植O-MSC+Bcl-兩組的射血分數(shù)與對照組和移植O-MSC組相比得到了明顯提高(圖7)。

        圖1 Bcl-2的轉(zhuǎn)染情況A:O-hMSCs轉(zhuǎn)染Bcl-2的GFP表達(400×); B:流式細胞儀測定Bcl-2的轉(zhuǎn)染效率

        圖2 缺氧處理前的O-MSC A:處理前OMSC;B:轉(zhuǎn)染Bcl-2的O-MSC

        圖3 缺氧處理后的O-MSC A:處理后O-MSC;B:轉(zhuǎn)染Bcl-2的O-MSC

        圖4 缺氧處理前后兩組細胞的早期凋亡對比分析

        圖5 術(shù)后四周大鼠心臟梗死邊緣區(qū)鏡下所見細胞存活情況(x400)A:O-MSC+Bcl-2;B:O-MSC,箭頭所指為人線粒體染色陽性細胞

        圖6 兩組細胞移植術(shù)后四周大鼠心臟梗死邊緣區(qū)細胞存活情況

        圖7 對照組、O-MSC組和O-MSC+Bcl-兩組術(shù)前、術(shù)后一周、兩周及四周射血分數(shù)

        討 論

        雖然既往大量動物實驗已經(jīng)證實骨髓間充質(zhì)干細胞移植能夠有效改善心肌梗死后的心臟功能[4],但在臨床研究中應(yīng)用自體間充質(zhì)干細胞治療心肌梗死效果明顯低于動物實驗的結(jié)果[5]。通過研究分析我們已經(jīng)證實,由于老年hMSCs在缺氧環(huán)境下的存活能力、血管再生能力和改善間質(zhì)重構(gòu)能力明顯弱于年輕患者[3]。因此,如果能夠增強老年hMSCs在心肌梗死區(qū)域的存活數(shù)量及存活時間即可解決自體干細胞移植治療心肌梗死的效果。

        細胞凋亡的分子和生化機制迄今雖尚未徹底明了[6-7],但已形成的初步認識大多源于對Bcl-2基因家族的研究[8-9],而Bcl-2基因的抑制凋亡作用在近年來的一些研究已得到了較為深入的研究,其抗凋亡作用已被廣泛認可[10]。Bcl-2抗細胞凋亡的機制可能在于Bcl-2與凋亡促進基因Bax形成二聚體、通過直接或間接的方式阻止胞漿內(nèi)細胞色素C對Caspases蛋白酶的激活、通過直接或間接地影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放等[11],從而實現(xiàn)抑制或調(diào)節(jié)細胞凋亡的發(fā)生。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)年輕hMSCs中的Bcl-2含量明顯高于老年hMSCs,而年輕hMSCs的抗缺氧損傷能力明顯強于老年hMSCs。因此,我們認為年齡可能影響了骨髓間充質(zhì)干細胞Bcl-2的分泌,使得這種能夠抑制細胞凋亡發(fā)生的“抗凋亡基因”隨著年齡的增高而減少,從而減少了老年hMSCs移植后的存活數(shù)量進而減弱了其治療心肌梗死的效果。在本項研究中,我們嘗試利用Bcl-2基因修飾了O-hMSC,使得轉(zhuǎn)染后的O-hMSCs在缺氧的培養(yǎng)環(huán)境中和移植至缺血缺氧的心肌梗死區(qū)域時均具有更強的存活能力,進而在動物實驗中證實了此種方法能夠增強O-hMSCs移植治療心肌梗死的效果。

        因此,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強自體骨髓間充質(zhì)干細胞存活能力的方法為解決目前自體骨髓間充干細胞治療缺血性心臟病效果不佳的難題提供了可能的解決方案,進而解決目前藥物治療、介入治療及手術(shù)治療難以改善缺血性心臟病患者遠期心功能對臨床醫(yī)生造成的困擾,從而改善廣大缺血性心臟病患者的遠期生存質(zhì)量和存活率。

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