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        Bcl-2改善老年人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抗缺氧損傷能力的研究

        2019-04-02 02:33:00張東旸蔣樹(shù)林
        心肺血管病雜志 2019年2期
        關(guān)鍵詞:充質(zhì)存活自體

        陳 巍 張東旸 白 龍 范 明 蔣樹(shù)林 田 海

        既往研究已經(jīng)證實(shí),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)能有效改善心肌梗死后的心臟功能[1-2]。然而,近年來(lái)在臨床研究中應(yīng)用自體hMSCs移植治療心肌梗死的效果卻不理想。前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)臨床心肌梗死患者多為老年人并進(jìn)一步證實(shí)了自體干細(xì)胞移植治療心肌梗死效果不佳的主要原因與供體年齡相關(guān),老年人hMSCs移植后的大量死亡可能影響了治療效果[3]。為進(jìn)一步探索改善老年人hMSCs治療心肌梗死效果的方法,本次研究將B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)轉(zhuǎn)染至老年hMSCs,以期增強(qiáng)老年hMSCs移植后的在心肌梗死心臟的存活能力,觀察能否增強(qiáng)老年hMSCs移植治療心肌梗死的效果。

        材料與方法

        1.材料 研究開(kāi)始前我院倫理委員會(huì)討論并通過(guò)了本實(shí)驗(yàn)中人類骨髓的獲取及研究,骨髓來(lái)源于我院心臟外科手術(shù)患者,取材前詳細(xì)告知患者或其家屬骨髓取材過(guò)程及用途,并簽訂知情同意書(shū),老年人骨髓來(lái)自于50~70歲心臟瓣膜病患者,有發(fā)紺、肝炎、梅毒、嚴(yán)重器官功能障礙或肺動(dòng)脈高壓的患者均被排除在供體選擇之外。大鼠由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,選擇12周齡清潔級(jí)雌性Wistar大鼠,體質(zhì)量200~250g。轉(zhuǎn)染用重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP/Bcl-2購(gòu)于上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司,Inspira小動(dòng)物呼吸機(jī)廠商為Harvard Apparatus。

        2.方法 (1)老年人hMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 心外科手術(shù)正中開(kāi)胸前,于胸骨抽取5 mL骨髓并加入等量的PBS后充分混勻,于離心管中加入與骨髓和PBS混合液等量的Ficoll離心液,并按1∶1的比例小心加入骨髓與PBS的混合液,以400倍重力,4℃條件下離心20min后,取中間白色單核細(xì)胞層接種到培養(yǎng)瓶中,用含10%胎牛血清和抗生素的IMDM培養(yǎng)基在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)液,此后每隔2~3 d換一次培養(yǎng)液至細(xì)胞80%匯合時(shí),應(yīng)用胰酶消化法(0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA)消化和傳代。第3代細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定,CD29、CD90、CD105陽(yáng)性而CD34、CD45、CD133陰性的即為目的細(xì)胞。

        (2)Bcl-2轉(zhuǎn)染老年hMSCs及鑒定 應(yīng)用上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供Bcl-2質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增和提取后,按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟將Bcl-2基因轉(zhuǎn)染至老年hMSCs,利用綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)染后48 h在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況并應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

        3.體外缺氧培養(yǎng)模型的建立 用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液將轉(zhuǎn)染前后的老年hMSCs配成單個(gè)細(xì)胞懸液,每組細(xì)胞每次測(cè)量共設(shè)3個(gè)復(fù)孔,以5 000個(gè)/孔的密度鋪于事先置于24孔板中的細(xì)胞載玻片上,每孔100μL的10%胎小牛血清IMDM在含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,各孔更換無(wú)血清IMDM培養(yǎng)液至終體積500μL,置于用含5%CO2和95%N2的混合氣體調(diào)整氧濃度至2%的37℃缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

        (4)缺氧培養(yǎng)后各組細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染前后的老年hMSCs經(jīng)過(guò)缺氧培養(yǎng)后,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟應(yīng)用Annexin V/PI雙染色法測(cè)定各組細(xì)胞缺氧前后早期凋亡情況并進(jìn)行對(duì)比。

        (5)大鼠心肌梗死模型的制備 Wistar大鼠,6~8周齡,(250±20)g,按體質(zhì)量給予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉,16G靜脈留置針氣管插管,小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸,以心尖搏動(dòng)最強(qiáng)點(diǎn)為中心,沿第四肋間做橫行切口,約2~3 cm,依次切開(kāi)皮膚、筋膜及肋間肌肉,以自制肋間拉鉤暴露術(shù)野,撕開(kāi)心包,結(jié)扎點(diǎn)在肺動(dòng)脈圓錐和心尖連線上,于左心耳下方1~2mm處進(jìn)針,方向與左心耳的邊緣平行,進(jìn)針深度約1.5mm,結(jié)扎時(shí)可見(jiàn)冠脈遠(yuǎn)端心肌變白,室壁運(yùn)動(dòng)明顯減弱,冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后15 min,將轉(zhuǎn)染前后老年hMSCs 2×106個(gè)細(xì)胞與同等體積培養(yǎng)基混合后注射到在缺血區(qū)和正常心肌交界區(qū)域,共選擇3點(diǎn),每點(diǎn)約40μL,關(guān)胸后每日觀察大鼠情況。

        (6)各組細(xì)胞移植后的存活檢測(cè) 術(shù)后四周大鼠腹腔注射9 mL/kg的10%水合氯醛,麻醉過(guò)量致死,迅速開(kāi)胸,阻斷主動(dòng)脈遠(yuǎn)端,于近端灌注4℃心臟停跳液約5 mL,至心臟停跳,取下心臟置于4%多聚甲醛中固定48 h,95%乙醇脫水,常規(guī)石蠟包埋。切片應(yīng)由心尖至心底按短軸平面連續(xù)切片,保證心尖、心底和心肌梗死區(qū)域都能切到,每張切片厚度約5μm。組織切片經(jīng)人線粒體染色后存活細(xì)胞呈棕色,每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)選取3張切片,每張切片選取5個(gè)放大200倍視野進(jìn)行觀察,計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù),從而計(jì)算各組細(xì)胞移植后的存活數(shù)量。

        (7)各組細(xì)胞移植后心功能的檢測(cè) 設(shè)定單純心肌梗死大鼠模型為對(duì)照組,以及老年細(xì)胞移植組和Bcl-2轉(zhuǎn)染后老年細(xì)胞移植組。實(shí)驗(yàn)大鼠在梗死模型建立前、梗死模型建立后1周、2周和4周行心臟超聲測(cè)量心功能。大鼠以3 mL/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,胸部剪毛,置仰臥位。11.5MHz探頭檢測(cè)對(duì)照組及各組細(xì)胞移植后不同時(shí)間點(diǎn)的EF并進(jìn)行對(duì)比分析。

        3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)都采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,比較分析采用t檢驗(yàn),采用重復(fù)測(cè)量方差比較分析超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組細(xì)胞移植后心功能情況。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1.老年hMSCs的培養(yǎng)、鑒定及轉(zhuǎn)染 按前述方法在術(shù)中獲得的骨髓經(jīng)分離培養(yǎng)至第3代時(shí),所獲細(xì)胞形態(tài)呈間充質(zhì)干細(xì)胞的長(zhǎng)梭型、成旋渦狀或放射狀排列,經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定穩(wěn)定表達(dá)表面抗原CD29、CD90、CD105,不表達(dá)其他干細(xì)胞細(xì)胞表面抗原CD34、CD45、CD133,轉(zhuǎn)染Bcl-2基因后能夠穩(wěn)定表達(dá)所帶綠色熒光蛋白,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為11.5%(圖1)。

        2.缺氧培養(yǎng)后的細(xì)胞凋亡情況 按前述方法進(jìn)行Anexin V/PI雙染后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè),可見(jiàn)缺氧前轉(zhuǎn)染前后O-MSC(the old mesenchymal stem cells)的早期凋亡幾乎沒(méi)有,而缺氧后兩組細(xì)胞的早期凋亡細(xì)胞數(shù)均有增多,且O-MSC組的早期凋亡細(xì)胞數(shù)較多(圖2~4)。

        3.移植后的細(xì)胞存活情況 兩組O-MSC移植術(shù)后四周,大鼠心臟切片經(jīng)人線粒體特異染色結(jié)果可見(jiàn)O-MSC+Bcl-兩組沿注射路徑分布的移植細(xì)胞呈圓形、被染成棕黃色,而O-MSC組中幾乎見(jiàn)不到存活的移植細(xì)胞(圖5~6)。

        4.移植后的心功能 超聲心動(dòng)圖結(jié)果所示術(shù)前各組間射血分?jǐn)?shù)無(wú)差別,術(shù)后不論是一周、兩周還是四周,O-MSC+Bcl-兩組的射血分?jǐn)?shù)與兩外兩組相比均有差異,對(duì)照組和O-MSC組相比未見(jiàn)到差異,因此移植O-MSC+Bcl-兩組的射血分?jǐn)?shù)與對(duì)照組和移植O-MSC組相比得到了明顯提高(圖7)。

        圖1 Bcl-2的轉(zhuǎn)染情況A:O-hMSCs轉(zhuǎn)染Bcl-2的GFP表達(dá)(400×); B:流式細(xì)胞儀測(cè)定Bcl-2的轉(zhuǎn)染效率

        圖2 缺氧處理前的O-MSC A:處理前OMSC;B:轉(zhuǎn)染Bcl-2的O-MSC

        圖3 缺氧處理后的O-MSC A:處理后O-MSC;B:轉(zhuǎn)染Bcl-2的O-MSC

        圖4 缺氧處理前后兩組細(xì)胞的早期凋亡對(duì)比分析

        圖5 術(shù)后四周大鼠心臟梗死邊緣區(qū)鏡下所見(jiàn)細(xì)胞存活情況(x400)A:O-MSC+Bcl-2;B:O-MSC,箭頭所指為人線粒體染色陽(yáng)性細(xì)胞

        圖6 兩組細(xì)胞移植術(shù)后四周大鼠心臟梗死邊緣區(qū)細(xì)胞存活情況

        圖7 對(duì)照組、O-MSC組和O-MSC+Bcl-兩組術(shù)前、術(shù)后一周、兩周及四周射血分?jǐn)?shù)

        討 論

        雖然既往大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠有效改善心肌梗死后的心臟功能[4],但在臨床研究中應(yīng)用自體間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死效果明顯低于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[5]。通過(guò)研究分析我們已經(jīng)證實(shí),由于老年hMSCs在缺氧環(huán)境下的存活能力、血管再生能力和改善間質(zhì)重構(gòu)能力明顯弱于年輕患者[3]。因此,如果能夠增強(qiáng)老年hMSCs在心肌梗死區(qū)域的存活數(shù)量及存活時(shí)間即可解決自體干細(xì)胞移植治療心肌梗死的效果。

        細(xì)胞凋亡的分子和生化機(jī)制迄今雖尚未徹底明了[6-7],但已形成的初步認(rèn)識(shí)大多源于對(duì)Bcl-2基因家族的研究[8-9],而B(niǎo)cl-2基因的抑制凋亡作用在近年來(lái)的一些研究已得到了較為深入的研究,其抗凋亡作用已被廣泛認(rèn)可[10]。Bcl-2抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能在于Bcl-2與凋亡促進(jìn)基因Bax形成二聚體、通過(guò)直接或間接的方式阻止胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C對(duì)Caspases蛋白酶的激活、通過(guò)直接或間接地影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放等[11],從而實(shí)現(xiàn)抑制或調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)年輕hMSCs中的Bcl-2含量明顯高于老年hMSCs,而年輕hMSCs的抗缺氧損傷能力明顯強(qiáng)于老年hMSCs。因此,我們認(rèn)為年齡可能影響了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Bcl-2的分泌,使得這種能夠抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生的“抗凋亡基因”隨著年齡的增高而減少,從而減少了老年hMSCs移植后的存活數(shù)量進(jìn)而減弱了其治療心肌梗死的效果。在本項(xiàng)研究中,我們嘗試?yán)肂cl-2基因修飾了O-hMSC,使得轉(zhuǎn)染后的O-hMSCs在缺氧的培養(yǎng)環(huán)境中和移植至缺血缺氧的心肌梗死區(qū)域時(shí)均具有更強(qiáng)的存活能力,進(jìn)而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了此種方法能夠增強(qiáng)O-hMSCs移植治療心肌梗死的效果。

        因此,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活能力的方法為解決目前自體骨髓間充干細(xì)胞治療缺血性心臟病效果不佳的難題提供了可能的解決方案,進(jìn)而解決目前藥物治療、介入治療及手術(shù)治療難以改善缺血性心臟病患者遠(yuǎn)期心功能對(duì)臨床醫(yī)生造成的困擾,從而改善廣大缺血性心臟病患者的遠(yuǎn)期生存質(zhì)量和存活率。

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