湯娜娜,王曉燕,張石玉,趙成光,蔣波,趙海燕,朱季軍

乙型肝炎病毒感染所致的慢性肝病是危害我國人民群眾健康的重要公共衛(wèi)生問題[1-3]。慢性肝病的進(jìn)展主要包括了機(jī)體的炎癥反應(yīng)及其修復(fù)過程，該過程可導(dǎo)致肝血管生成、肝臟的纖維化、肝硬化，甚至肝癌[4]。肝纖維化的特征是由細(xì)胞外基質(zhì)代替肝細(xì)胞，特別是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和膠原，會(huì)導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的紊亂[5]。血管生成素2(Angiopoietin-2, Ang-2)是一類內(nèi)皮生長因子的家族成員，其功能主要參與病理性血管損傷與重建[6]。近年有報(bào)道Ang-2參與丙型肝炎后肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，但是在乙肝后肝硬化中尚未見報(bào)道。本研究將探討Ang-2在乙肝后肝硬化患者血清中的水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取宿遷市第一人民醫(yī)院2016年1月至2018年8月收治的92例乙肝后肝硬化患者作為肝硬化組，另選取同期宿遷市第一人民醫(yī)院門診體檢健康的志愿者92例作為健康對照組。肝硬化組，男67例，女25例，平均年齡(47.5±8.1)歲；肝硬化程度：代償期肝硬化33例、失代償期肝硬化59例；Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)33例、B級(jí)40例、C級(jí)19例。健康對照組，男67例、女25例，平均年齡(46.7±7.9)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過，納入的研究對象均了解本研究目的，自愿簽訂知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合2015版慢性乙型肝炎防治指南中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7-8]的乙肝后肝硬化患者；或肝臟生化相關(guān)指標(biāo)無異常，既往無肝病病史，無其他系統(tǒng)性疾病及惡性腫瘤的健康志愿者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

①其它原因造成的肝損或肝硬化；②近2周內(nèi)有服用可能影響肝功能藥物者；③妊娠期婦女；④疑似或確診的惡性腫瘤患者；⑤既往或現(xiàn)有大量飲酒史。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清樣本收集

住院病人入院后，或門診體檢人員，清晨空腹，抽取外周靜脈血約10 mL，進(jìn)行離心10 min(3 200 r/min)，取上清，存于干燥管中，并置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 Ang-2含量測定

取冷存血清標(biāo)本約2.0 mL，室溫下解凍，取ELISA試劑盒(SEA009Hu，USCN，中國武漢)凍干粉溶解制備標(biāo)準(zhǔn)品，選用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測定血清中Ang-2含量，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Ang-2水平比較

肝硬化組血清中Ang-2水平為(5 962.8±2 227.5)pg/mL，顯著高于健康對照組的(3 590.1±1 483.1)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.505，P<0.001)。在肝硬化患者中，失代償期患者Ang-2水平為(7 340.6±1 411.0)pg/mL，顯著高于肝硬化代償期患者的(3 499.6±862.6)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.203，P<0.001)，見圖1。另外根據(jù)Child分級(jí)將肝硬化患者分為3組，可以看到隨著分級(jí)提高，血清中的Ang-2水平明顯上升(兩兩比較P值均< 0.001)。

A：健康對照組(n=92)vs. 肝硬化組(n =92)；B：肝硬化代償期(n =33)vs. 肝硬化失代償(n =59)；C：Child分級(jí)A級(jí)(n =33)vs. B級(jí)(n =40)vs. C級(jí)(n =19)

2.2 血清Ang-2水平與肝纖四項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性

納入研究對象血清中Ang-2蛋白的含量與肝臟纖維化指標(biāo)[層粘連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸酶(HA)、Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)及Ⅳ型膠原(C-Ⅳ)]呈顯著相關(guān)性(P均<0.001)，見表1。

表1 184例研究對象血清Ang-2含量與肝臟纖維四項(xiàng)相關(guān)性分析

2.3 不同血清Ang-2水平患者肝硬化比率比較

將所有研究對象(即健康人群和肝硬化人群)按Ang-2含量排序(從低到高)進(jìn)行三等分組(T1，n=61；T2，n=61；T3，n=62)，分析其肝硬化患者的百分比。隨著Ang-2水平的提高，肝硬化患者的百分比亦升高(T1-T3，24.6%、44.3%、80.6%，P< 0.001及l(fā)inear-by-linear association,P<0.001)，見圖2。

圖2 不同血清Ang-2水平患者肝硬化比率比較

2.4 Ang-2含量判斷肝硬化的ROC曲線

采用入院時(shí)血清中Ang-2含量判斷納入研究對象是否患有乙肝后肝硬化，制作ROC曲線，顯示AUC為0.795(95% CI, 0.732-0.859)，P<0.001，見圖3。根據(jù)Youden index判斷，最佳敏感度為0.522，特異度為1.000，其最佳界值為5 965.5 pg/mL。

圖3 Ang-2判斷乙肝后肝硬化的ROC曲線

3 討論

血管生成素是一類作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)蛋白家族，包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4[6]。其通過識(shí)別酪氨酸激酶-2受體(Tie-2)，在炎癥所致的血管重構(gòu)及腫瘤血管生成和增長中發(fā)揮重要作用[9]。Ang-1被認(rèn)為是Tie-2的活化配體，而Ang-2由于與Ang-1高度同源，以相似親和力與Tie-2結(jié)合，因此被看做是Tie-2的拮抗劑[9-10]。Ang-2在血管重構(gòu)的組織中由活化的內(nèi)皮細(xì)胞分泌，可通過拮抗Ang-1來促進(jìn)血管生成。在血管重建活動(dòng)較弱的靜止組織中，Ang-2水平較低。而在炎癥和血管活躍生成的組織中，Ang-2的表達(dá)量會(huì)顯著增加[10-11]。

肝臟活檢病理是對肝臟慢性病進(jìn)行診斷和分期的金標(biāo)準(zhǔn)[11-13]。但是活檢評(píng)價(jià)肝臟纖維化一方面受到取樣區(qū)域的選擇以及病理醫(yī)生主觀的影響，另一方面由于其有創(chuàng)性及潛在的并發(fā)癥的約束，并不適合長期監(jiān)測評(píng)估慢性肝病患者的病程，無法對患者臨床治療管理提供動(dòng)態(tài)的依據(jù)[14-16]。

慢性肝病病程中的肝纖維化和肝硬化往往與肝內(nèi)病理性血管生成密切相關(guān)[17-18]。既往研究證實(shí)，肝硬化的進(jìn)展體現(xiàn)在血管密度的提高和相關(guān)血管生長因子高表達(dá)[18-19]。西班牙的科學(xué)家近年發(fā)現(xiàn)：Ang2與丙肝后肝纖維化進(jìn)程相關(guān)，對肝硬化分期具有良好的特異性和敏感性，可作為一項(xiàng)潛在的檢測肝纖維化進(jìn)程的生物標(biāo)記物[19-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，乙肝后肝硬化患者血清中Ang-2水平明顯升高；與肝硬化代償期患者相比，失代償期患者Ang-2明顯上升；同時(shí)，隨著肝功能Child分級(jí)提高，血清中的Ang-2也顯著增加。但是，同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，Child A級(jí)患者血清的Ang-2水平與健康人群并無差異。因此，Ang-2可能并不適合用于區(qū)別健康人群與肝硬化代償期患者。此外，Ang-2還與肝臟纖維指標(biāo)HA、PC-III以及C-IV呈正相關(guān)。在本研究納入研究對象中，血清中Ang-2含量越高，其患有肝硬化的概率越高。最后，ROC曲線下受試者工作曲線顯示，Ang-2具有良好的判斷肝硬化的能力，其最佳界值為5 965.5 pg/mL，敏感度為0.522，特異度為1.000。

本研究也尚有一些不足：①未納入慢性乙肝但無肝硬化的患者；②樣本量較少，仍需多中心大樣本的研究進(jìn)一步驗(yàn)證；③未來的研究中納入其它原因造成的肝損患者，如自身免疫性肝病或丙型肝炎等。

本研究第一次報(bào)道了Ang-2在乙肝后肝硬化中的水平變化，Ang-2或可作為乙肝后肝硬化的生物標(biāo)記物，特別是應(yīng)用于判斷肝硬化失代償期患者；與健康人群鑒別時(shí)顯示出較好的特異度。