姜曉倩，趙嶺嶺，李景光，劉艷彩，吳春平

結(jié)腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤疾病，隨著人類生活方式和運(yùn)動(dòng)方式的改變，結(jié)腸癌發(fā)病率呈逐漸升高趨勢，成為威脅人類健康的又一非傳染性疾病[1]。目前臨床主要以手術(shù)切除治療為主，但需盡早發(fā)現(xiàn)和診斷，以及早采取手術(shù)切除治療。然結(jié)腸癌早期臨床癥狀無特異性，缺乏特異性特征，易被掩飾，從而致早期診斷十分困難[2]。有調(diào)查發(fā)現(xiàn)[3-4]，長期大量使用阿司匹林等非甾體類抗炎藥物者，其發(fā)生結(jié)腸癌率可降低40%～50%，但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚，因此致該藥物推廣及應(yīng)用受限。以往有研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，非甾體類抗炎藥物可通過抑制環(huán)氧化酶途徑來抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移。環(huán)氧化酶主要是催化花生四烯酸代謝產(chǎn)生前列腺素的限制速酶，其與人類多種腫瘤相關(guān)，并參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程。有研究發(fā)現(xiàn)[7]，誘導(dǎo)型COX-2過度表達(dá)致人體PGs水平升高在人類多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用，同時(shí)其還可有效抑制腫瘤細(xì)胞凋亡等，對促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有一定作用，因此研究COX-2表達(dá)水平具有重要價(jià)值。骨橋蛋白可通過與受體整合素等結(jié)合來加速細(xì)胞遷移等，與多種腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等有關(guān)，此外，其還可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，加速細(xì)胞外基質(zhì)降解等[8]。本文研究為探討COX-2、OPN在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)狀況，特收集相關(guān)樣本進(jìn)行研究，以提高對結(jié)腸癌的診斷，更好的改善患者預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院病理科2015年1月～2018年12月期間存檔的100例結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本作為觀察組，腫瘤直徑<5 cm者48例、≥5 cm者52例；浸潤漿膜者69例、浸潤漿膜及肌層者31例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期22例、Ⅲ～Ⅳ期78例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：轉(zhuǎn)移者54例、無轉(zhuǎn)移者46例；中高分化者40例、低分化者60例；年齡25～75歲，平均(55.6±2.6)歲；男70例、女30例。另選取100例癌旁正常組織作為研究對照組。兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

分別應(yīng)用免疫組化法檢測兩組OPN與COX-2表達(dá)情況，試劑：兔抗人COX-2單克隆抗體、鼠抗人OPN單克隆抗體、封閉用正常山羊血清工作液和兔血清封閉液及生物素標(biāo)記二抗工作液、DAB顯色液。過氧化物酶標(biāo)鏈霉卵白素工作液，均購置于北京中山生物技術(shù)公司。4 μm連續(xù)石蠟切片，然后貼附于潔凈的載玻片上，并放置于60 ℃烤箱中烘烤，時(shí)間180 min；石蠟切片，并脫蠟至水；采用3%過氧化氫進(jìn)行孵育，時(shí)間為5 min，采用蒸餾水沖洗，應(yīng)用PBS溶液浸泡5 min，于pH6.0的10 mm枸緣酸鈉緩沖液中加熱，共10 min，再采用10%兔、山羊血清進(jìn)行封閉，10 min；將血清倒去，加入COX-2/OPN一抗，并采用PBS作陰性對照，于4℃環(huán)境下孵育過夜。采用PBS溶液沖洗5 min，共3次；然后再滴加二抗，于37 ℃環(huán)境下孵育30 min；采用PBS溶液沖洗5 min，共3次，滴加采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，于37 ℃環(huán)境下孵育30 min；采用PBS溶液沖洗5 min，共3次，再次滴加新鮮配制的DAB顯色劑，用水沖洗，并采用蘇木素復(fù)染，應(yīng)用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3 觀察指標(biāo)

分析兩者表達(dá)水平與臨床病理特征間的相關(guān)性。陽性：細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒；選取陽性細(xì)胞較為集中的區(qū)域10個(gè)(400倍)，然后計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，如陽性細(xì)胞≥10%則判斷為陽性，否則為陰性。由我院2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生在不知病理資料情況進(jìn)行獨(dú)立計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)數(shù)資料以%表示，采用卡方檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OPN、COX-2在結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中的陽性表達(dá)情況

觀察組中OPN表達(dá)陽性率為84.0%，明顯高于對照組17.0%，2=89.789，P=0.000；觀察組中COX-2陽性表達(dá)率78.0%，明顯高于對照組32.0%，2=42.747，P=0.000。見表1。

表1 OPN、COX-2在結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中的陽性表達(dá)情況

2.2 OPN在結(jié)腸癌組織中陽性表達(dá)情況

OPN在結(jié)腸癌組織中陽性表達(dá)與腫瘤TNM分期和分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，P<0.05；見表2。

表2 OPN在結(jié)腸癌組織中陽性表達(dá)情況

2.3 COX-2在結(jié)腸癌組織中陽性表達(dá)情況

COX-2陽性表達(dá)與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，P<0.05；見表3。

2.4 PN陽性表達(dá)與COX-2陽性表達(dá)相關(guān)性

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，100例結(jié)腸癌組織中，OPN陽性表達(dá)與COX-2陽性表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.412，P=0.002)。

3 討論

結(jié)腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤疾病，目前尚未完全清楚其發(fā)病機(jī)制，隨著人們生活飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)腸癌發(fā)病率逐漸升高，給人們生命健康造成極大威脅[9-10]。腫瘤發(fā)生和生長及浸潤、轉(zhuǎn)移是一個(gè)較為復(fù)雜的變化過程，與較多因素有關(guān)，因此了解腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等誘發(fā)因子具有重要價(jià)值[11]。骨和軟組織腫瘤的病理診斷應(yīng)該從僅由形態(tài)學(xué)判讀轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N檢測手段和檢測指標(biāo)相結(jié)合的診斷方式，免疫組化和分子分型是主要的診斷方法。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)以及基因重組等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，對結(jié)腸腫瘤病理過程中的相關(guān)分子事件及其相關(guān)臨床意義的了解也日益深入，為人類結(jié)腸癌的早期診斷、治療以及預(yù)測預(yù)后提供了更多渠道與手段。結(jié)腸癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移與癌癥的浸潤深度、組織學(xué)分型、分級等有關(guān)，但國內(nèi)外研究對這些病理指標(biāo)的相關(guān)性、哪些是預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素仍存在爭議。骨橋蛋白最先是從惡性轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞株中所提取的，其主要是一種與腫瘤有關(guān)的蛋白質(zhì)，可通過與受體整合素、CD44結(jié)合來加速腫瘤細(xì)胞粘附和細(xì)胞外基質(zhì)降解來達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的目的，此外，其還可促進(jìn)新生血管形成，抑制人體免疫功能，最終致腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移[12]。較多研究發(fā)現(xiàn)[13]，OPN在臨床實(shí)體腫瘤與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞等研究中，人們發(fā)現(xiàn)OPN與腫瘤轉(zhuǎn)移存在緊密聯(lián)系。OPN可增強(qiáng)腎上腺癌細(xì)胞株NCI-H295侵襲能力，同時(shí)還可通過轉(zhuǎn)染整合素avβ3來增強(qiáng)OPN侵襲力，此外，OPN過度表達(dá)還可胃癌及乳腺癌等腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和惡性程度等存在緊密聯(lián)系，OPN表達(dá)陽性者預(yù)后偏差[14]。本次研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織標(biāo)本中OPN陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，P<0.05；由此說明OPN在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，此外，OPN陽性表達(dá)與腫瘤分期和分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在緊密聯(lián)系，但與患者年齡和性別及腫瘤大小無明顯關(guān)聯(lián)，這與當(dāng)前各文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[15]。

表3 COX-2在結(jié)腸癌組織中陽性表達(dá)情況

環(huán)氧化酶主要是人體前列腺素(PGs)合成過程中的限速酶，環(huán)氧化酶可將花生四烯酸代謝為各種前列腺素產(chǎn)物，而前列腺素產(chǎn)物可參與到人體生理、病理過程中。COX-2在多數(shù)腫瘤中呈現(xiàn)為過度表達(dá)，而COX-2過度表達(dá)與肺癌和前列腺癌及胃癌等淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤及預(yù)后不良存在緊密聯(lián)系[16-17]。本次研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織標(biāo)本中COX-2陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，這是因COX-2過度表達(dá)可通過合成致癌物質(zhì)和促進(jìn)腫瘤血管新生及促進(jìn)腫瘤粘附等環(huán)節(jié)來加速腫瘤生成、發(fā)展。由此說明COX-2過度表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展存在緊密聯(lián)系[1]。本文研究發(fā)現(xiàn)，COX-2與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期有關(guān)，但與患者性別和年齡及腫瘤大小、分化程度無明顯關(guān)聯(lián)，這與當(dāng)前各學(xué)者研究報(bào)道結(jié)果一致[19-20]；說明COX-2在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，臨床可通過檢測COX-2表達(dá)水平來判斷結(jié)腸癌是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對評估患者預(yù)后具有重要價(jià)值。此外，本次研究還發(fā)現(xiàn)，100例結(jié)腸癌組織中，OPN陽性表達(dá)與COX-2陽性表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.412，P=0.002)。由此說明聯(lián)合檢測兩者陽性表達(dá)狀況可為腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)測及早期轉(zhuǎn)移等提供重要依據(jù)。

綜上所述，檢測骨橋蛋白與環(huán)氧化酶-2表達(dá)水平可有利于臨床判斷結(jié)腸癌患者預(yù)后，尤其是聯(lián)合檢測，對了解結(jié)腸癌組織浸潤及轉(zhuǎn)移具有重要價(jià)值。盡管本次研究取得明顯成效，但對于OPN、COX-2的具體作用機(jī)制還有待深入研究與探討。