李 珉, 劉海濤, 侯金鳳, 王成剛, 李文東, 車寶泉

(北京市藥品檢驗(yàn)所, 中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206)

米格列奈(mitiglinide),化學(xué)名為2-(S)-芐基-4-氧代-4-(順-全氫異吲哚-2-基)丁酸,是一種新型的苯甲酸衍生物類降糖藥物,2004年由日本Kissei制藥公司在日本首次上市[1,2],其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。近年來,國(guó)內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)主要為基于反相色譜的米格列奈有關(guān)物質(zhì)的分析,以及基于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)或超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)的米格列奈含量測(cè)定方法[3-11],然而這些方法均未實(shí)現(xiàn)米格列奈異構(gòu)體的分離,且均未對(duì)米格列奈的質(zhì)譜裂解機(jī)理有任何報(bào)道。對(duì)米格列奈異構(gòu)體的分離,大多采用基于手性色譜的方法對(duì)光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分離[12,13]。而對(duì)米格列奈進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),其可能存在多種非光學(xué)異構(gòu)體,這些異構(gòu)體往往沒有藥效活性,因此實(shí)現(xiàn)對(duì)其非光學(xué)異構(gòu)體的分離具有重要意義。近年來,藥物的非光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)引起越來越多的關(guān)注,各種藥物的異構(gòu)體分離方法常有報(bào)道[14-20]。2014年,Sastry等[21]報(bào)道了多種米格列奈可能的異構(gòu)體雜質(zhì),其中僅包含一種非光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì),且研究表明其并無藥效活性。同年,周曉蘭[22]建立了可以實(shí)現(xiàn)該位置異構(gòu)體與米格列奈分離的反相液相色譜方法。本文在此基礎(chǔ)上,建立了成功分離米格列奈與3種異構(gòu)體的反相超高效液相色譜方法,并結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù),對(duì)米格列奈及其異構(gòu)體可能的裂解機(jī)理進(jìn)行了推斷。

圖 1 米格列奈鈣的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structure of mitiglinide calcium

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜-Q Exactive四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司),配有ESI源;XA205型電子天平(d=0.01 mg,瑞士Mettler Toledo公司); Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司)。

米格列奈鈣(批號(hào)為20160501-D,純度99.95%)和米格列奈鈣消旋體對(duì)照品(批號(hào)為2016070401,純度98.7%)均由德州博誠(chéng)制藥有限公司提供。甲酸、乙腈(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Merck公司,正戊醇(色譜純)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

米格列奈鈣原料樣品(批號(hào)分別為0320160401、01616015、150801、MG-161101和170401Y)分別由德州博誠(chéng)制藥有限公司、連云港潤(rùn)眾制藥有限公司、浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司、江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司和煙臺(tái)正方制藥有限公司提供。

1.2 溶液的配制

米格列奈鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取米格列奈鈣對(duì)照品適量,用水-乙腈(2∶1, v/v)溶解、定容,配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液,于4 ℃保存(有效期10天)。每次使用前,用水-乙腈(2∶1, v/v)逐級(jí)稀釋,配制成米格列奈質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000和10 000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取米格列奈鈣對(duì)照品10.41 mg,置于100 mL容量瓶中,加適量水-乙腈(2∶1, v/v)溶解,100 ℃水浴破壞1 h,放冷至室溫,定容;精密量取1 mL,置100 mL量瓶中,用水-乙腈(2∶1, v/v)定容。

消旋體對(duì)照溶液 精密稱取米格列奈鈣消旋體對(duì)照品10.67 mg,置于100 mL容量瓶中,加適量水-乙腈(2∶1, v/v)溶解,定容。精密量取1 mL,置100 mL量瓶中,用水-乙腈(2∶1, v/v)定容,配制成質(zhì)量濃度約為1 000 μg/L的溶液。

供試品溶液 精密稱取米格列奈鈣原料樣品適量,用水-乙腈(2∶1, v/v)溶解、定容,配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的溶液。

1.3 破壞試驗(yàn)操作過程

取米格列奈鈣原料約10 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,加溶劑(水-乙腈(2∶1, v/v))5 mL,超聲并時(shí)時(shí)振蕩使溶解,將上述溶液平行配制6份,記作溶液A,分別按下述條件進(jìn)行破壞試驗(yàn)。

酸破壞:在溶液A中加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL,于室溫下放置4 h,加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL,再加溶劑稀釋至刻度,搖勻,即得。

堿破壞:在溶液A中加入1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL,于室溫下放置4 h,加1 mol/L鹽酸溶液1 mL,再加溶劑稀釋至刻度,搖勻,即得。

氧化破壞:在溶液A中加入6%(v/v)過氧化氫溶液1 mL,于室溫下放置4 h,加溶劑稀釋至刻度,搖勻,即得。

高溫破壞:在溶液A中加溶劑稀釋至刻度,搖勻,于100 ℃水浴破壞4 h,放冷至室溫,用溶劑稀釋至刻度,搖勻,即得。

強(qiáng)光照破壞:在溶液A中加溶劑稀釋至刻度,搖勻,于4 500 lx光照條件下放置約4 h,取出,即得。

紫外光照破壞:在溶液A中加溶劑稀釋至刻度,搖勻,于紫外光照條件下放置約4 h,取出,即得。

1.4 儀器分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC?HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);流動(dòng)相:水-乙腈-正戊醇(75∶25∶1, v/v/v),用甲酸調(diào)節(jié)pH至1.8;流速:0.4 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI;掃描模式:正離子;檢測(cè)模式:單離子監(jiān)測(cè)模式二級(jí)掃描(SIM/dd MS2);一級(jí)離子掃描范圍(m/z): 314.190 7～318.190 7;二級(jí)離子掃描范圍(m/z): 50～350;一級(jí)分辨率:70 000 FWHM;二級(jí)分辨率:17 500 FWHM;噴霧電壓:3.5 kV;離子傳輸管溫度:325 ℃;汽化溫度:350 ℃;鞘氣壓(N2): 40 arb;輔助氣壓(N2): 10 arb; S-Lens: 55 V; HCD碰撞氣:氮?dú)?碰撞電壓:35 eV。

表 1 米格列奈及其3個(gè)異構(gòu)體雜質(zhì)的母離子及各碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)Table 1 Accurate masses of parent ion and each fragment ions of mitiglinide and its three isomer impurities

2 結(jié)果與討論

2.1 方法分離情況

將1.2節(jié)中系統(tǒng)適用性溶液按1.4節(jié)中條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見圖2a。

圖 2 米格列奈(a)系統(tǒng)適用性溶液與(b)消旋體對(duì)照 溶液的提取離子流色譜圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of (a)mitiglinide system suitability solution and (b) mitiglinide racemic solution

從圖2a可以看出,在單離子監(jiān)測(cè)模式(SIM)下,米格列奈的[M+H]+(m/z=316.190 72)的提取離子流色譜圖(EIC)可得到4個(gè)不同的色譜峰。對(duì)4個(gè)色譜峰的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較,結(jié)果見表1,各峰的精確質(zhì)量數(shù)與米格列奈[M+H]+的精確質(zhì)量數(shù)316.190 72相比,偏差均在2×10-6以內(nèi),可斷定4個(gè)色譜峰為4個(gè)不同的同分異構(gòu)體,其中含量最高的2號(hào)峰為米格列奈主成分,其余3個(gè)峰為米格列奈異構(gòu)體雜質(zhì)。因此,建立的反相液相色譜方法可以實(shí)現(xiàn)米格列奈主成分與3種異構(gòu)體雜質(zhì)的分離。

將1.2節(jié)中消旋體對(duì)照溶液按1.4節(jié)中條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見圖2b?？梢钥闯?消旋體在本次建立的液相色譜方法中未能實(shí)現(xiàn)分離,因此3種異構(gòu)體雜質(zhì)均排除了光學(xué)異構(gòu)體的可能性。

圖 3 米格列奈及其3個(gè)異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 3 MS/MS spectra of mitiglinide and its three isomers a. mitiglinide; b. isomer impurity 1; c. isomer impurity 2; d. isomer impurity 3.

2.2 米格列奈及其異構(gòu)體雜質(zhì)的質(zhì)譜碎裂情況及裂解機(jī)理分析

米格列奈及其3個(gè)異構(gòu)體雜質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖3。米格列奈及其3個(gè)異構(gòu)體雜質(zhì)的母離子及各碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)見表1。

由表1可見,米格列奈及其3個(gè)異構(gòu)體雜質(zhì)的母離子及質(zhì)荷比(m/z)超過120的各碎片離子的質(zhì)量數(shù)偏差均在2 10-6以內(nèi)?？梢娒赘窳心渭捌?個(gè)異構(gòu)體雜質(zhì)的碎片離子的質(zhì)荷比基本相同。但由圖3可見,m/z分別為145、173和190的碎片離子的相對(duì)豐度存在明顯差異。其中米格列奈的3個(gè)碎片離子相對(duì)豐度約為5∶6∶1,異構(gòu)體雜質(zhì)1的3個(gè)碎片離子相對(duì)豐度約為10∶5∶1,異構(gòu)體雜質(zhì)2和異構(gòu)體雜質(zhì)3的3個(gè)碎片離子相對(duì)豐度約為1.2∶1.3∶1。根據(jù)母離子的精確質(zhì)量數(shù)以及各子離子的精確質(zhì)量數(shù),推斷米格列奈的質(zhì)譜裂解機(jī)理(見圖4)。與文獻(xiàn)[22]對(duì)比,米格列奈異構(gòu)體1的色譜相對(duì)保留情況及各子離子豐度與米格列奈已知的一種位置異構(gòu)體基本一致,因此推測(cè)米格列奈異構(gòu)體1為米格列奈的位置異構(gòu)體,根據(jù)該已知結(jié)構(gòu)以及二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù),推斷米格列奈異構(gòu)體雜質(zhì)1的質(zhì)譜裂解機(jī)理(見圖4)。異構(gòu)體雜質(zhì)2和異構(gòu)體雜質(zhì)3之前未見文獻(xiàn)報(bào)道,且二者的一級(jí)質(zhì)譜圖及二級(jí)質(zhì)譜圖均無明顯差異,因此本研究中未能確認(rèn)其結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜裂解機(jī)理。根據(jù)其m/z為190的碎片離子豐度明顯高于米格列奈主成分及異構(gòu)體雜質(zhì)1這一現(xiàn)象,推測(cè)其可能的結(jié)構(gòu)及裂解機(jī)理(見圖4)。

2.3 方法的檢出限、定量限、重復(fù)性和線性范圍

將1.2節(jié)中的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液逐級(jí)稀釋,分別按1.4節(jié)中條件進(jìn)行測(cè)定,以信噪比(S/N)大于3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢出限,信噪比(S/N)大于10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限,最終測(cè)得檢出限為1 μg/L,定量限為2 μg/L。

將米格列奈質(zhì)量濃度為100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.2%,峰面積的RSD為2.0%,可以滿足分析要求。

將1.2節(jié)中的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別按1.4節(jié)中的條件進(jìn)行測(cè)定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得到的線性回歸方程為:Y=5.03×105X+1.09×107,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 7,線性良好。然而對(duì)該線性擬合進(jìn)行F檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)由于線性范圍超過4個(gè)數(shù)量級(jí),不同數(shù)量級(jí)對(duì)線性的貢獻(xiàn)差異較大,導(dǎo)致低濃度存在失擬的情況,結(jié)果偏差較大。因此,采用分別將質(zhì)量濃度與峰面積取對(duì)數(shù)的方法進(jìn)行線性回歸,得到的線性回歸方程為:Y=0.977 2X+5.787 3,相關(guān)系數(shù)r2為0.999 9,線性良好。該取對(duì)數(shù)線性擬合F檢驗(yàn)結(jié)果良好,在各濃度條件下結(jié)果偏差均較小,因此后續(xù)定量實(shí)驗(yàn)均采用取對(duì)數(shù)擬合線性方程進(jìn)行計(jì)算。

2.4 異構(gòu)體雜質(zhì)來源的分析

將1.3節(jié)中的各破壞試驗(yàn)溶液,分別按1.4節(jié)中條件進(jìn)行測(cè)定,采用主成分自身對(duì)照法,用2.3節(jié)中取對(duì)數(shù)得到的線性回歸方程進(jìn)行計(jì)算,從而得出3種異構(gòu)體雜質(zhì)的溶液濃度,以測(cè)定破壞試驗(yàn)所得3種異構(gòu)體雜質(zhì)含量,結(jié)果見表2。

由表2可見,除異構(gòu)體雜質(zhì)1在加熱條件下含量明顯增加外,其他條件下均未有異構(gòu)體雜質(zhì)含量顯著變化的情況。說明異構(gòu)體雜質(zhì)1可由米格列奈加熱降解得到,而異構(gòu)體雜質(zhì)2與異構(gòu)體雜質(zhì)3則在各破壞試驗(yàn)條件下穩(wěn)定,因此考慮其為合成工藝雜質(zhì)。此外,異構(gòu)體雜質(zhì)1的降解情況與文獻(xiàn)[22]中米格列奈已知位置異構(gòu)體的降解情況一致,結(jié)合2.2節(jié)內(nèi)容可基本確認(rèn)異構(gòu)體雜質(zhì)1為米格列奈位置異構(gòu)體。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

將各企業(yè)提供的米格列奈鈣原料按1.2節(jié)配制成供試品溶液,并按1.4節(jié)中條件進(jìn)行測(cè)定。采用主成分自身對(duì)照法,用2.3節(jié)中取對(duì)數(shù)得到的線性回歸方程進(jìn)行計(jì)算,得到各企業(yè)提供的米格列奈鈣原料樣品中3種異構(gòu)體雜質(zhì)的含量(見表3)?？梢钥闯?各企業(yè)間異構(gòu)體雜質(zhì)1的含量存在明顯差異,個(gè)別企業(yè)可達(dá)到0.1%;而各企業(yè)異構(gòu)體雜質(zhì)2和異構(gòu)體雜質(zhì)3的含量相差不大,且含量較低,均低于0.01%。

表 2 各破壞試驗(yàn)樣品中3種異構(gòu)體雜質(zhì)的含量Table 2 Percentages of the three isomer impurities in the samples of different degradation tests

表 3 各企業(yè)米格列奈鈣原料樣品中3種異構(gòu)體雜質(zhì)的含量Table 3 Percentages of the three isomer impurities in the samples of the mitiglinide calcium raw material

3 結(jié)論

本文建立了可以實(shí)現(xiàn)米格列奈及其3種異構(gòu)體分離的RPLC-MS方法,該方法線性良好,靈敏度高,可滿足分析需求。同時(shí)利用高分辨質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)及碎裂情況對(duì)米格列奈及其異構(gòu)體進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)其碎片離子豐度存在明顯差異,從而確認(rèn)異構(gòu)體雜質(zhì)2和異構(gòu)體雜質(zhì)3為首次發(fā)現(xiàn)的異構(gòu)體雜質(zhì),并對(duì)米格列奈及各異構(gòu)體雜質(zhì)可能的質(zhì)譜裂解機(jī)理進(jìn)行了推斷。在此基礎(chǔ)上,對(duì)異構(gòu)體雜質(zhì)來源進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體雜質(zhì)1可在高溫下降解產(chǎn)生,而異構(gòu)體雜質(zhì)2和異構(gòu)體雜質(zhì)3在各破壞試驗(yàn)中穩(wěn)定,因此考慮其為合成雜質(zhì)。對(duì)各企業(yè)原料進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)各企業(yè)異構(gòu)體雜質(zhì)含量存在一定差異。因此,在今后的工作中,對(duì)新發(fā)現(xiàn)的兩種合成產(chǎn)生的異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究,可能對(duì)各企業(yè)改善其米格列奈原料合成工藝提供新的思路和方向。