李園園, 張 鑫, 陳煒杰, 劉紅陽, 孫立權(quán), 羅愛芹

(北京理工大學(xué), 北京 100081)

分子印跡技術(shù)(molecularly imprinting technique, MIT)起源于“抗原-抗體”學(xué)說,其識(shí)別機(jī)理與“鎖鑰原理”相似[1]。分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)的制備過程是,模板分子與功能單體先通過共價(jià)鍵、氫鍵、分子間作用力等作用力形成“模板-功能單體復(fù)合物”,再在交聯(lián)劑的作用下聚合成空間三維結(jié)構(gòu),最后將模板分子去除,在聚合物內(nèi)形成與模板分子形狀、大小、官能團(tuán)互補(bǔ)的印跡空穴[2-4]。制備得到的分子印跡聚合物具有較好的穩(wěn)定性、便捷性,并且具有特異的識(shí)別能力[5]。因此,分子印跡技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到分離、催化、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[6-8]。

膜分離技術(shù)是指借助膜的選擇滲透作用,在能量或化學(xué)位差的推動(dòng)下對(duì)混合物中溶質(zhì)和溶劑進(jìn)行分離、分級(jí)、提純和富集[9]。分子印跡膜技術(shù)是將分子印跡技術(shù)和膜分離技術(shù)相結(jié)合,因此,分子印跡聚合物膜(molecularly imprinted polymers membranes, MIMs)兼具了二者易于分離、能耗低的優(yōu)勢(shì),其制備方法與傳統(tǒng)的印跡方法相比,可避免研磨、篩分等繁瑣程序[10-14]。現(xiàn)已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了分子印跡膜在生物分離、分析方面的良好應(yīng)用。例如,丘秀珍等[15]以多巴胺為模板,多孔陽極氧化鋁膜為反應(yīng)載體,合成了分子印跡聚合物膜,其吸附平衡時(shí)間為60 min,最大吸附容量為82.1 μmol/g,對(duì)模板分子的印跡因子為2.1,該方法簡(jiǎn)便、快速、選擇性高,適用于檢測(cè)人體尿液中的兒茶酚胺類藥物的含量。呂春暉等[16]以恩諾沙星分子為模板制備了印跡聚合物膜,其高親和位點(diǎn)的最大吸附量為12.98 μg/mL,吸附平衡時(shí)間為60 min,可分析檢測(cè)恩諾沙星在食品中的殘留。Jahanshahi等[17]以2,4-二氯苯氧乙酸為模板分子制備了分子印跡聚合物膜,對(duì)模板分子選擇性因子為12.96,吸附平衡時(shí)間為60 min,吸附量為34.57 mg/g,可用于選擇性識(shí)別和分離水溶液中的2,4-二氯苯氧乙酸。Kong等[18]以雙酚A為模板分子制備了印跡聚合物膜,其吸附平衡時(shí)間為30 min,對(duì)模板分子具有特異識(shí)別能力,可用于雙酚A的痕量檢測(cè)。

目前分子印跡聚合物膜存在結(jié)合位點(diǎn)少、吸附平衡時(shí)間長、吸附量小等問題。本文結(jié)合分子印跡技術(shù)和膜分離技術(shù),以溶菌酶為模板蛋白質(zhì),利用原位聚合法在硅烷化的基質(zhì)玻片上成功制備了溶菌酶分子印跡聚合物膜,解決了印跡聚合物膜結(jié)合位點(diǎn)少的問題,制備的印跡聚合物膜對(duì)溶菌酶具有較快的吸附速率、較高的吸附效率、良好的識(shí)別能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

紫外分光光度計(jì)(UV-1800,日本島津公司,日本);臺(tái)式恒溫振蕩器(TIIZ-D,太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DH101-1BS,天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司);超聲波清洗器(KQ5200,昆山市超聲儀器有限公司)。

溶菌酶(Lyz,Mr1.44 kDa, pI 11.2,生物技術(shù)級(jí))、卵清蛋白(OVA,Mr4.5 kDa, pI 4.7,純度98%)、人血清白蛋白(HSA,Mr6.6 kDa, pI 4.6,純度99.5%)均購自原葉生物有限公司;丙烯酰胺(AAm,分析純)購自天津化學(xué)試劑研究所;N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA,分析純)、過硫酸銨(APS,分析純)均購自北京化學(xué)試劑公司;γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷偶聯(lián)劑(KH570,化學(xué)純)購自曲阜晨光化工有限公司;四甲基乙二胺(TEMED,純度>99%)購自北京夢(mèng)怡美生物科技有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS,化學(xué)純)購自西隴化工股份有限公司;乙酸(AA,分析純)購自北京市通廣精細(xì)化工公司;十二水磷酸氫二鈉(分析純)、二水磷酸二氫鈉(分析純)、甲苯(分析純)、三乙胺(分析純)均購自北京化工廠;聚對(duì)苯二甲酸乙二酯板片(PET薄膜)購自廣州鈺新材料有限公司;雞蛋購自北京理工大學(xué)菜市場(chǎng)。

1.2 溶菌酶印跡聚合物膜的制備

1.2.1基質(zhì)材料的準(zhǔn)備

基質(zhì)材料處理過程如下:將載玻片制成1.0 cm×1.5 cm大小,用去離子水和無水乙醇反復(fù)清洗,氮?dú)獯蹈?用濃硫酸-過氧化氫水溶液(85∶15, v/v)的混合溶液浸泡3 h后,用去離子水和無水乙醇反復(fù)清洗,氮?dú)獯蹈?最后,將上述基質(zhì)玻片浸入4 mL KH570、0.4 mL三乙胺和100 mL甲苯的混合溶液中反應(yīng)12 h,獲得的玻片用甲苯反復(fù)沖洗后氮?dú)獯蹈?室溫下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2溶菌酶分子印跡聚合物膜的制備

溶菌酶分子印跡聚合物膜的制備過程如下:首先,精準(zhǔn)稱取10 mg Lyz、550 mg AAm于4 mL磷酸緩沖溶液(pH=6.0, 40 mmoL,下同)中,超聲溶解后加入10 mg交聯(lián)劑MBA,反應(yīng)30 min,再加入4 mg APS、10 μL TEMED,完全溶解后得到預(yù)聚合溶液;其次,將60 μL的預(yù)聚合溶液小心滴加于硅烷化的基質(zhì)玻片上,待到溶液均勻鋪平后,用PET膜覆蓋,在室溫下聚合24 h后,去除PET膜片,獲得溶菌酶印跡聚合物膜(MIP);最后,將MIP浸入體積分?jǐn)?shù)為10%的AA與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的SDS混合水溶液中,振蕩洗脫去除模板蛋白質(zhì),用去離子水振蕩洗滌多次,直至洗滌水pH呈中性。為了進(jìn)一步研究印跡過程對(duì)Lyz吸附的影響,實(shí)驗(yàn)還制備了非印跡聚合物膜(non-imprinted polymer, NIP)作為對(duì)照,NIP的制備除不加入模板蛋白質(zhì)Lyz之外,其余步驟同上。

1.3 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

在室溫條件下,分別將MIP、NIP放入Lyz標(biāo)準(zhǔn)溶液中進(jìn)行孵育,每隔一段時(shí)間測(cè)定溶液的紫外吸光度,記錄并計(jì)算MIP、NIP在不同時(shí)間對(duì)Lyz的吸附量。

用磷酸緩沖溶液配制質(zhì)量濃度為200 μg/mL的Lyz標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后分別將MIP、NIP置于其中孵育,每隔一段時(shí)間測(cè)定溶液的紫外吸光度,記錄并計(jì)算MIP、NIP在不同時(shí)間對(duì)Lyz的吸附量。

1.4 吸附等溫線實(shí)驗(yàn)

用磷酸緩沖溶液分別配制質(zhì)量濃度范圍在0到700 μg/mL的Lyz標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、50、100、200、300、400、500、600、700 μg/mL),然后分別將MIP、NIP置于溶液中孵育,使用紫外分光光度計(jì)記錄不同溶液的紫外吸光值,計(jì)算在不同溶液中MIP對(duì)Lyz的最大吸附量。Lyz吸附量使用公式(1)計(jì)算:

Q=(A0-A)·V/(k·M)

(1)

式中,Q是聚合物對(duì)模板蛋白質(zhì)的吸附容量(mg/g),A0是標(biāo)準(zhǔn)溶液初始吸光度,A是標(biāo)準(zhǔn)溶液用聚合物吸附后的吸光度,V是吸附溶液的體積(mL),k是模板蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(mL/μg),M是聚合物的質(zhì)量(g)。

1.5 吸附選擇性實(shí)驗(yàn)

用磷酸緩沖溶液分別配制一系列不同質(zhì)量濃度的Lyz、HSA、OVA標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別將MIP、NIP置入不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液的紫外吸光度,計(jì)算MIP、NIP對(duì)Lyz、HSA、OVA的最大吸附量。采用印跡因子(IF)評(píng)價(jià)聚合物膜的識(shí)別特異性:

(2)

式中,QMIP和QNIP分別為MIP、NIP對(duì)蛋白質(zhì)的吸附容量(mg/g)。

1.6 溶菌酶分子印跡聚合物膜的重復(fù)使用性測(cè)定

將MIP放入質(zhì)量濃度為200 μg/mL的Lyz標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸附5 min,使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)Lyz吸光值。然后用1.2.2節(jié)中的洗脫方法將Lyz洗脫后再次進(jìn)行吸附,重復(fù)此步驟5次。

1.7 聚合物膜用于實(shí)際樣品

選用雞蛋清作為蛋白質(zhì)源來考察聚合物膜在實(shí)際樣品中對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的吸附能力。首先取雞蛋清上清液,稀釋200倍,對(duì)其進(jìn)行全波段掃描后,將MIP、NIP置于樣品溶液中進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)。吸附平衡后,對(duì)樣品溶液再次進(jìn)行全波段掃描,觀察樣品溶液中Lyz特征吸收峰的變化,根據(jù)公式(1)計(jì)算吸附量。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物膜的制備

MIP的制備過程如圖1所示。具體如下:用濃硫酸和過氧化氫水溶液處理載玻片,既可除去雜質(zhì),又可使其表面羥基化;經(jīng)KH570、三乙胺和甲苯的混合溶液反應(yīng)后,羥基化的玻片表面進(jìn)一步接枝雙鍵,有利于聚合物膜固定以及模板蛋白的結(jié)合。在此基礎(chǔ)上,以Lyz為模板蛋白質(zhì),AAm為功能單體,MBA為交聯(lián)劑制備MIP。

圖 1 溶菌酶印跡聚合物膜的制備過程Fig. 1 Preparation of lysozyme-imprinted polymer membrane KH570: silane coupler; Lyz: lysozyme; AAm: acrylamide; MBA: N,N′-methylene bisacrylamide.

2.2 印跡體系的優(yōu)化

2.2.1功能單體

功能單體的用量是影響印跡聚合物吸附性能的重要因素。本實(shí)驗(yàn)考察了AAm的用量對(duì)MIP吸附性能的影響,所得結(jié)果如圖2所示:隨著AAm用量的增加,制備的MIP對(duì)Lyz的吸附量增大,當(dāng)AAm的用量為550 mg時(shí),其吸附量最大,以后隨著AAm的增加其吸附量反而有所降低,這表明功能單體AAm的最優(yōu)用量為550 mg。

圖 2 功能單體用量對(duì)溶菌酶印跡聚合物吸附量的影響Fig. 2 Effect of the amount of functional monomer on the adsorption capacity of lysozyme-imprinted polymer membrane

圖 3 交聯(lián)劑用量對(duì)溶菌酶印跡聚合物吸附量的影響Fig. 3 Effect of the amount of crosslinking agent on the adsorption capacity of lysozyme-imprinted polymer membrane

2.2.2交聯(lián)劑

交聯(lián)劑的基本作用是固定客體的鍵合點(diǎn),使之處于牢固的三維結(jié)構(gòu)中。在本實(shí)驗(yàn)中,固定AAm的用量為550 mg,考察了不同用量的交聯(lián)劑對(duì)MIP吸附性能的影響。由圖3可知,隨著交聯(lián)劑用量的增加,MIP對(duì)模板分子的吸附量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)交聯(lián)劑的用量為10 mg時(shí),其吸附量達(dá)到最大值。這是因?yàn)楫?dāng)交聯(lián)劑用量過少時(shí),所形成的MIP過低,從而導(dǎo)致吸附量降低;但當(dāng)交聯(lián)劑用量過多時(shí),形成的MIP過大,導(dǎo)致Lyz分子識(shí)別位點(diǎn)減少,MIP吸附效果較差。

2.3 吸附動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)對(duì)制備的聚合物膜的吸附平衡時(shí)間進(jìn)行了考察。如圖4所示,在Lyz質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí),MIP的吸附量隨著時(shí)間增加,在起初的5 min內(nèi),吸附量快速增加,5 min之后,吸附達(dá)到平衡,吸附量為23 mg/g; NIP對(duì)模板蛋白質(zhì)的吸附平衡時(shí)間較長,在11 min時(shí)達(dá)到吸附平衡,吸附量為8 mg/g,與MIP相差較大。相對(duì)NIP, MIP達(dá)到吸附平衡所用的時(shí)間更短,吸附速率更快。這主要是因?yàn)樵贛IP上具有能特異結(jié)合Lyz的印跡位點(diǎn),所以結(jié)合速率更快,吸附量更大。

圖 4 溶菌酶質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)聚合物膜的吸附動(dòng)力學(xué)Fig. 4 Absorption kinetic curve of polymer membrane at lysozyme concentration of 200 μg/mL

2.4 吸附等溫線的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察MIP對(duì)Lyz的吸附能力。Lyz的質(zhì)量濃度在0到700 μg/mL的范圍內(nèi),測(cè)定了MIP、NIP的吸附等溫線。一般來說,對(duì)吸附能力進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí),最常用的模型是Langmuir吸附方程和Freundlich吸附方程[19,20],將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別對(duì)兩種方程進(jìn)行擬合。結(jié)果表明,MIP更符合Langmuir吸附方程,公式如下:

(3)

式中,Q和Qmax分別是聚合物對(duì)模板蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)吸附容量(mg/g)和最大理論吸附容量(mg/g),Ce為吸附平衡后溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度(mg/mL),K為聚合物對(duì)模板蛋白質(zhì)吸附的Langmuir吸附平衡常數(shù)(mL/mg)。

圖 5 溶菌酶印跡聚合物膜的吸附等溫線Fig. 5 Adsorption isotherms of lysozyme-imprinted polymer membrane

以Q對(duì)Ce作圖得到MIP的吸附等溫線,如圖5所示。采用Langmuir吸附模型進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合,得到的擬合曲線具有較好的擬合度(R2=0.9665)。由擬合結(jié)果可知,MIP對(duì)Lyz的理論最大吸附量是42.5 mg/g。

2.5 吸附選擇性的考察

為了評(píng)價(jià)MIP對(duì)Lyz的特異性識(shí)別能力,選用HSA、OVA作為參照蛋白質(zhì),分別考察了MIP、NIP對(duì)3種蛋白質(zhì)的吸附情況。由圖6可知,MIP對(duì)Lyz最大吸附量是32.9 mg/g,遠(yuǎn)高于其對(duì)HSA(10 mg/g)、OVA(9 mg/g)的吸附量。NIP對(duì)Lyz、HSA、OVA的吸附量均不高。MIP對(duì)模板分子的印跡因子為3.0,明顯高于對(duì)HSA、OVA的印跡因子,這是由于HSA、OVA與Lyz的結(jié)構(gòu)、等電點(diǎn)不同,與MIP的印跡位點(diǎn)不匹配,所以MIP對(duì)這兩種參照蛋白的結(jié)合量少,而對(duì)Lyz表現(xiàn)出了高選擇性。而NIP不存在特異性空穴,所以對(duì)3種蛋白質(zhì)的吸附量相差不大。

圖 6 溶菌酶印跡聚合物膜的選擇性吸附Fig. 6 Selective adsorption of lysozyme-imprinted polymer membraneHSA: human serum albumin; OVA: ovalbumin.

圖 7 溶菌酶印跡聚合物膜的重復(fù)使用性Fig. 7 Reusability of the lysozyme-imprinted polymer membrane

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

為了考察MIP的重復(fù)使用能力,對(duì)其進(jìn)行批次吸附實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖7所示。隨著使用次數(shù)的增多,MIP對(duì)Lyz的吸附量略有降低,使用5次之后,吸附量由32.9 mg/g降到31.2 mg/g,下降了5%。這說明MIP表面具有均勻、穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu),其在反復(fù)振蕩、洗脫過程中,吸附位點(diǎn)損失較少?？傮w看來,MIP具有良好的重復(fù)使用性。

2.7 聚合物膜用于分離實(shí)際樣品中的模板蛋白質(zhì)

實(shí)驗(yàn)選用雞蛋清為樣品,對(duì)制備的聚合物膜的實(shí)際應(yīng)用能力進(jìn)行了考察。由圖8可觀察到,用MIP、NIP對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)后,Lyz的特征吸收峰峰值由0.618分別降低到0.595和0.609,根據(jù)公式(1)分別計(jì)算出MIP、NIP對(duì)Lyz的吸附量為30和12 mg/g。結(jié)果表明,相對(duì)NIP, MIP在實(shí)際樣品中有良好的吸附效果,可用于實(shí)際樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離。

圖 8 聚合物膜吸附雞蛋清樣品中溶菌酶的光譜圖Fig. 8 Spectrum of lysozyme adsorption by polymer membrane from egg white a. the egg white before adsorption; b. the egg white after adsorption by non-imprinted polymer; c. the egg white after adsorption by imprinted polymer.

3 結(jié)論

本文以溶菌酶為模板蛋白質(zhì),丙烯酰胺為功能單體,N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑,制備了溶菌酶分子印跡聚合物膜。結(jié)果表明,制備的印跡聚合物膜的吸附特征符合Langmuir吸附方程,實(shí)際最大吸附量為32.9 mg/g,吸附平衡時(shí)間為5 min,印跡因子為3.0。本實(shí)驗(yàn)采用的原位聚合法增強(qiáng)了聚合物的柔韌性及力學(xué)性能。因此,本實(shí)驗(yàn)制備的蛋白質(zhì)分子印跡膜還可以進(jìn)一步推廣應(yīng)用于生物樣品中其他蛋白質(zhì)的高效分離。