張碧瑩，錢籽霖，唐 玲，張 靜，蔣和體*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

甘薯味道甜美，營養(yǎng)價(jià)值高，富含VA、VB、VC、VE、β-胡蘿卜素、葉酸、類黃酮、酚酸等天然抗氧化成分[1]。日本國立癌癥預(yù)防研究所公布的抗癌蔬菜中，甘薯名列榜首[2]。研究表明，清除自由基的抗氧化類食品可表現(xiàn)出不同程度的延緩衰老作用[3]，尤其值得一提的是紫甘薯提取物具有延長果蠅壽命[4]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[5]、保護(hù)由叔丁基過氧化氫氧化應(yīng)激所致的小鼠肝細(xì)胞損傷等功效[6]。

近年來，關(guān)于甘薯的研究集中在植物化學(xué)物質(zhì)提取、分離純化和生物活性方面，如糖酯類、酮類提取物的抗癌功能，花色苷類提取物的抗突變功能，有機(jī)酸類提取物抑制黑色素產(chǎn)生功能，甘薯糖蛋白的降血脂、降血糖、抗突變、抗衰老功能[7-9]。國內(nèi)對于甘薯汁飲料的研究也局限在工藝水平，其深加工產(chǎn)品及藥用功效方面的研究較少。如果甘薯及其制品中的多糖、糖蛋白等功能因子成分在抗衰老的預(yù)防及抗氧化效果上存在某種交互作用，則可以摒棄經(jīng)濟(jì)成本高且繁瑣的提取工藝，選擇一種加工簡便、經(jīng)濟(jì)劃算、符合人們消費(fèi)理念及營養(yǎng)追求的方便飲品（如甘薯汁）來滿足人們通過合理膳食達(dá)到抗衰老的需求。本實(shí)驗(yàn)選用遺傳學(xué)模式生物——果蠅進(jìn)行生命周期實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)生化指標(biāo)測定，研究甘薯汁對果蠅壽命及體內(nèi)抗氧化酶活性的影響，旨在為甘薯汁在抗衰老方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）由西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物遺傳學(xué)教研室提供。

甘薯品種為‘渝薯17號’，取自重慶市石柱縣甘薯基地。測得‘渝薯17號’主要成分含量分別為：水分77.62%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、總灰分1.50%、淀粉16.21%、多糖21.60%、蛋白質(zhì)1.51%、脂肪0.19%、VC 24.12 mg/100 g、β-胡蘿卜素3.16 mg/100 g。玉米粉、瓊脂、白糖、酵母粉均購自永輝超市。

丙酸、考馬斯亮藍(lán)G-250（分析純） 成都市科龍化工試劑廠；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004A 電子天平 上海精天電子儀器廠；VD-650型無菌操作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；QL-901型漩渦混勻器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；WFJ 7200型可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；HWS-26數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；HERMLE2323K低溫高速離心機(jī) 上海精密儀器有限公司；JYZ-E96原汁機(jī) 九陽股份有限公司；玻璃勻漿器 上海雷布斯儀器有限公司；HH BII 600-S電熱恒溫生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 甘薯汁的制備

甘薯清洗、去皮后刨絲，采用螺旋壓榨使汁液與薯渣分離（出汁率約為50%～65%），5 000 r/min離心20 min，取上清液于微波爐中加熱至90 ℃，保持40～60 s滅酶，冷卻至室溫。添加α-淀粉酶0.33 mL/kg，于63 ℃水浴中液化，2.0 h后滅酶處理并冷卻；再加入復(fù)合糖化酶0.40 mL/kg，于61 ℃水浴中糖化，2.0 h后滅酶處理。酶解液用100 目細(xì)紗布過濾，灌裝于馬口鐵罐中，于121 ℃高溫蒸汽殺菌15 min。

測得所制甘薯汁樣品含蛋白質(zhì)1.43%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、VC 4.00 mg/100 g、β-胡蘿卜素1.04 mg/100 g、總酚691.73 mg/L、黃酮520.94 mg/L。樣品置于4 ℃冷藏備用。

1.3.2 果蠅培養(yǎng)基的制備

1.3.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制參考李津[4]的方法并略作改動：玉米粉72 g、無水葡萄糖72 g、瓊脂粉6 g、干酵母粉10 g、丙酸6 mL、水750 mL。將無水葡萄糖、瓊脂粉邊緩慢倒入已盛水的鍋中加熱，邊不停攪拌，待充分溶解后將已攪拌均勻的玉米糊倒入鍋中，煮沸，?；鸷罄鋮s2 min左右至80 ℃加入酵母粉及丙酸。趁熱分裝于經(jīng)180 ℃干熱滅菌2 h的培養(yǎng)管中，每管培養(yǎng)基高度約2.0～3.0 cm，室溫放置到凝固后再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，備用。

1.3.2.2 樣品培養(yǎng)基

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加甘薯汁溶液，分別配制質(zhì)量濃度為0.10、0.15、0.20 mg/mL的低、中、高3 組劑量的培養(yǎng)基，攪拌均勻后立即分裝于經(jīng)180 ℃干熱滅菌2 h的培養(yǎng)管中，每管培養(yǎng)基高度約2.0～3.0 cm，室溫放置到凝固后再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中備用。

1.3.3 抗氧化性的測定

采用鄰二氮菲法[10]測定羥自由基（·OH）清除率；采用鄰苯三酚法[11]測定超氧陰離子自由基（O2-·）清除率；2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定方法參考文獻(xiàn)[12-13]。

1.3.4 果蠅壽命的測定

收集1 600 只8 h內(nèi)羽化未交配的果蠅，隨機(jī)分為對照組和3 個(gè)質(zhì)量濃度梯度組，每組果蠅雌、雄各200 只，對照組飼喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，劑量組飼喂含甘薯汁的培養(yǎng)基。飼養(yǎng)條件：（25±1）℃、相對濕度50%～70%，避光。每隔48 h記錄死亡數(shù)，計(jì)算平均壽命、半數(shù)死亡時(shí)間和最高壽命等指標(biāo)。最后10 只果蠅死亡時(shí)間的算術(shù)平均數(shù)作為最高壽命[14]。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.5 果蠅SOD活力、T-AOC、MDA含量的測定

參考文獻(xiàn)[15-16]的方法，收集6 000 只8 h內(nèi)羽化未交配的果蠅，隨機(jī)分為對照組和3 個(gè)質(zhì)量濃度梯度組，每組果蠅雌、雄各750 只，飼喂管理?xiàng)l件同1.3.4節(jié)，于第0、10、20天時(shí)測定每組果蠅體內(nèi)的SOD活力、T-AOC及MDA含量。每個(gè)樣本稱取雄蠅48 mg、雌蠅56 mg，分別加入0.6、0.7 mL生理鹽水，在冰浴條件下用玻璃勻漿器制備勻漿。根據(jù)試劑盒按步驟測定每組果蠅組織上清液中SOD活力、T-AOC及MDA含量，測定結(jié)果分別以U/mg pro、mL/mg pro和nmol/mg pro表示。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.6 果蠅蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法[17]，適當(dāng)稀釋1.3.5節(jié)果蠅組織勻漿上清液，于595 nm波長處測定吸光度，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝4.707 1x-0.003 9，R2＝0.997 2。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以±s表示，制圖使用Origin 8.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯汁的抗氧化活性

圖 1 不同質(zhì)量濃度甘薯汁清除自由基能力Fig. 1 Free radical scavenging activity of sweet potato juice at different concentrations

由圖1可知，對于O2-·及·OH來說，甘薯汁清除能力隨質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)，且質(zhì)量濃度達(dá)到0.20 mg/mL時(shí)清除能力最強(qiáng)，分別達(dá)到75.36%和55.25%。對ABTS陽離子自由基及DPPH自由基的清除率范圍在86.99%～98.31%，且自由基清除率隨質(zhì)量濃度變化不大。以上結(jié)果表明甘薯汁具有良好的體外抗氧化作用，這可能與甘薯汁具有較高含量的總酚、黃酮等活性物質(zhì)有關(guān)。

2.2 甘薯汁對果蠅壽命的影響

表 1 不同質(zhì)量濃度甘薯汁對果蠅壽命的影響（n＝200）Table 1 Effects of different concentrations of sweet potato juice on life span in D. melanogaster (n= 200)

由表1可知，各甘薯汁劑量組雌、雄果蠅半數(shù)死亡時(shí)間、平均壽命和平均最高壽命均高于對照組，且存在質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。與對照組相比，各甘薯汁劑量組雌性果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間分別延長了3、6、10 d（P＜0.05），雄性果蠅分別延長了2、4、7 d（P＜0.05）。對于果蠅的平均壽命，雌性果蠅3 個(gè)劑量組平均壽命延長率分別達(dá)到了5.31%、11.17%和17.93%，雄性果蠅分別達(dá)到了4.79%、9.40%和16.00%。最高壽命可以體現(xiàn)出果蠅對具有功能因子物質(zhì)的適應(yīng)性及耐受性[18]，其中高劑量組對平均最高壽命的延長效果最佳，雌、雄果蠅平均最高壽命分別延長了6.20、4.75 d（P＜0.01），與對照組相比分別提高了8.63%、6.75%，低劑量組對雌、雄果蠅平均最高壽命延長差異不顯著（P＞0.05）。通過雌、雄組的對比還可以發(fā)現(xiàn)，雌果蠅的平均壽命、平均最高壽命以及半數(shù)死亡時(shí)間均比雄果蠅增長快，說明甘薯汁對雌果蠅壽命影響高于雄果蠅，這可能是雌性果蠅與雄性果蠅對受試藥物的敏感性不同造成的[19]。

圖 2 不同甘薯汁劑量組雄性（A）和雌性（B）果蠅存活率Fig. 2 Survival curves of male (A) and female (B) fl ies with dietary supplementation of different concentrations of sweet potato juice

由圖2可知，在果蠅生長初期（0～24 d），對照組和各劑量組存活率差異不明顯（P＞0.05）；從48 d后果蠅存活率發(fā)生了明顯改變，各劑量存活率均高于對照組，且高劑量組的延壽效果最為明顯（P＜0.05）。綜合表1和圖2的結(jié)果，分析果蠅半數(shù)死亡時(shí)間、平均壽命、平均最高壽命及果蠅不同時(shí)期的存活率，發(fā)現(xiàn)高劑量組效果更好，這對甘薯汁保健藥用開發(fā)具有一定的參考價(jià)值。

2.3 甘薯汁對果蠅SOD活力的影響

SOD是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)具有代表性的酶類，能專一地清除體內(nèi)有害自由基，避免其氧化體內(nèi)的某些成分致使機(jī)體受到損害[20]。Cutler[21-23]和Wang Haifeng[24]等發(fā)現(xiàn)SOD對12 種靈長類和兩種嚙齒類動物代謝率具有重要作用。Tolmasoff等[25]也曾報(bào)道靈長類動物的壽命與SOD活力有關(guān)。

表 2 不同質(zhì)量濃度甘薯汁對果蠅SOD活力的影響（n＝200）Table 2 Effects of different concentrations of sweet potato juice on SOD activity in D. melanogaster (n= 200)U/mg pro

表2顯示了新羽化果蠅用添加了甘薯汁的培養(yǎng)基飼養(yǎng)第0、10、20天時(shí)其SOD活力的變化。果蠅SOD活力隨果蠅生長時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，即清除氧自由基的能力有所降低，這與張欣文等[26]的研究結(jié)果相符合。與對照組相比，低、中劑量組雌、雄果蠅在飼喂樣品第10天時(shí)SOD活力均較同時(shí)間對照組有顯著差異（P＜0.05）。中、高劑量組雌、雄果蠅在第10、20天時(shí)SOD活力與對照組相比有極顯著差異（P＜0.01），其中高劑量組在第10天時(shí)雌、雄果蠅體內(nèi)SOD活力都為最高，分別為22.20、24.87 U/mg pro，較對照組提高了50.51%和58.61%。表明在一定甘薯汁質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，果蠅體內(nèi)SOD活力隨質(zhì)量濃度提高而增強(qiáng)[4]。且雄蠅在飼喂第10、20天時(shí)體內(nèi)SOD活力均比雌蠅高，說明甘薯汁對提高雄果蠅體內(nèi)SOD活力表現(xiàn)出更強(qiáng)的作用，能增強(qiáng)機(jī)體抗氧化脂質(zhì)程度。

2.4 甘薯汁對果蠅T-AOC的影響

總抗氧化物是體內(nèi)非酶促和酶促系統(tǒng)抗氧化物質(zhì)的總和，T-AOC可綜合反映機(jī)體的抗氧化能力[27]。雌、雄果蠅在食用不同質(zhì)量濃度甘薯汁添加物10、20 d后，分別檢測與氧化應(yīng)激能力相關(guān)的抗氧化物質(zhì)T-AOC。

由表3可知，果蠅T-AOC隨果蠅生長時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，與SOD活力變化相同。飼喂樣品第10天時(shí)，中劑量組較對照組能顯著提高雄、雌果蠅T-AOC，分別提高35.97%和26.78%（P＜0.05）；高劑量組能極顯著提高雄、雌果蠅的T-AOC（P＜0.01），分別高達(dá)5.97、5.32 mL/mg pro，較對照組分別提高62.67%和79.73%。甘薯汁表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，很可能源于其上調(diào)SOD和T-AOC mRNA的表達(dá)水平，通過消除氧自由基抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生和提高抗氧化酶活性的途徑發(fā)揮延緩衰老的作用[28]。

表 3 不同質(zhì)量濃度甘薯汁對果蠅T-AOC的影響（n＝200）Table 3 Effects of different concentrations of sweet potato juice on T-AOC in D. melanogaster (n = 200)mL/mg pro

2.5 甘薯汁對果蠅MDA含量的影響

MDA是自由基對不飽和脂肪酸引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，它與蛋白質(zhì)、肽類或脂類聚合物交聯(lián)，不斷堆積老年色素或脂褐質(zhì)，致使機(jī)體衰老[29-30]。MDA含量與自由基數(shù)量、脂質(zhì)過氧化的程度變化趨勢一致，因此MDA含量能客觀地反映機(jī)體自由基的水平及脂質(zhì)過氧化程度[31]。

表 4 不同質(zhì)量濃度甘薯汁對果蠅MDA含量的影響（n＝200）Table 4 Effects of different concentrations of sweet potato juice on MDA content in D. melanogaster (n= 200)nmol/mg pro

由表4可知，MDA含量隨著果蠅生長時(shí)間的延長而呈現(xiàn)升高的趨勢，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)初期果蠅處于青年期，清除體內(nèi)自由基的能力較強(qiáng)，酶的活性也相對較高，能更好地抑制體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成。當(dāng)果蠅步入機(jī)體衰老期，伴隨著生理和免疫功能大幅度下滑，體內(nèi)非酶促與酶促系統(tǒng)清除自由基的能力也依次下降，這與健康成年人體內(nèi)MDA含量的變化情況相似[32-33]。對照組的MDA含量增加幅度比各劑量組的MDA含量增加幅度要大，說明甘薯汁有延緩果蠅體內(nèi)MDA含量增加的作用。第10、20天時(shí)，低劑量組較同時(shí)間對照組沒有顯著差異（P＞0.05），中劑量組有顯著性差異（P＜0.05），高劑量組有極顯著性差異（P＜0.01）；其中第20天時(shí)，高劑量組雌、雄果蠅較同時(shí)間對照組分別降低了35.59%和37.14%。同一劑量組中雌蠅的MDA含量比雄蠅高，這可能是由于雄蠅體型較小，體內(nèi)的脂質(zhì)含量少，過氧化脂質(zhì)程度低，故其體內(nèi)MDA含量較少[34]。

3 討 論

果蠅生存史短暫、繁殖速度高、飼養(yǎng)條件簡單，且具有與人類相似的代謝途徑和衰老基因[35-36]，已在衛(wèi)生部發(fā)布的《保健食品功能學(xué)評價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》中被用作動物模型來研究抗衰老活性及動物抗衰老機(jī)制。機(jī)體清除自由基的能力和自由基代謝產(chǎn)物的含量是決定衰老速度的重要因素[37-39]。本實(shí)驗(yàn)通過果蠅生存實(shí)驗(yàn)和生化指標(biāo)測定法分析了果蠅半數(shù)死亡時(shí)間、平均壽命和平均最高壽命，果蠅體內(nèi)SOD活力、T-AOC、MDA含量等變化情況。結(jié)果表明，甘薯汁各劑量組均能延長果蠅的壽命，在一定甘薯汁質(zhì)量濃度范圍內(nèi)和清除自由基能力呈正相關(guān)，且果蠅體內(nèi)抗氧化酶的活性隨年齡的增大而呈現(xiàn)降低趨勢。但由于物種間存在一定差異，甘薯汁對果蠅延緩壽命及提高抗氧化能力的作用并不能完全代表其對人體具有療效，其抗衰老臨床應(yīng)用亟待研究。