孫思明，徐宏偉，郭凱元，郭夢(mèng)冉，崔勝男，崔 同，檀建新*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001）

原花青素（proanthocyanidins，PCs）是一類以黃烷醇及其衍生物為結(jié)構(gòu)單元的多酚類聚合物，其種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有極強(qiáng)的抗氧化作用[1-2]。經(jīng)檢測(cè)，87 個(gè)科的600多種種子植物中都含有PCs，其中山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）富含PCs，且構(gòu)成PCs的結(jié)構(gòu)單元只有表兒茶素，平均聚合度低，只有2～3 個(gè)聚合度[3]。

研究表明，從食物中攝取的PCs具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[4]、抗氧化[5]、抗衰老[6]、抗腫瘤[7]、預(yù)防老年癡呆[8]、降血壓血脂[9]、預(yù)防心血管疾病[10]等作用。這些功能可能與其抗氧化作用和對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。研究證明，PCs能夠有效地清除·、·OH、NO·、ONOO-·、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、·CH3等自由基[11]，保護(hù)內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，加強(qiáng)體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)。Jord?o等[12]發(fā)現(xiàn)葡萄酒清除自由基能力和抗氧化活性與其PCs含量之間呈線性關(guān)系；Wang Xinghui等[13]研究表明葡萄籽PCs可以通過(guò)提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量來(lái)改善去氧皮質(zhì)酮-鹽型高血壓小鼠模型的氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解高血壓癥狀。細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞自身基因控制的自主有序死亡，PCs對(duì)細(xì)胞凋亡有雙向調(diào)節(jié)作用[3]，這種作用可能是通過(guò)其調(diào)節(jié)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平來(lái)完成的。實(shí)驗(yàn)證明，低聚原花青素能夠通過(guò)減少ROS生成、降低細(xì)胞Ca2+濃度來(lái)緩解六溴環(huán)十二烷的細(xì)胞毒性，減少人肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡[14]。另一方面，人們發(fā)現(xiàn)PCs可以引起多種腫瘤細(xì)胞如乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胃腺癌細(xì)胞的凋亡。Faria等[15]證明葡萄籽PCs除了抗氧化活性外，還具備很強(qiáng)的抑制人乳腺癌株MCF-7細(xì)胞DNA合成的能力，從而能夠抑制癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

自由基清除實(shí)驗(yàn)表明PCs清除能力的高低可能與其羥基數(shù)量、沒(méi)食子?；潭?、單體組成、單體間連接方式及聚合度等有關(guān)[16-18]。用PCs處理細(xì)胞也得到了類似的結(jié)果。Lizarraga等[19]的研究表明葡萄籽PCs的平均聚合度和沒(méi)食子?；潭纫哂谒蓸淦ぶ械腜Cs，高聚合度和沒(méi)食子?；潭鹊钠咸炎裀Cs具有更高的ROS清除能力和誘導(dǎo)人腸癌HT29細(xì)胞凋亡作用，并且證明了PCs清除自由基的能力和使DNA濃縮斷裂及抗癌細(xì)胞增殖能力間呈正相關(guān)。Lozano等[20]發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡能力可能與兒茶素沒(méi)食子酰基化有關(guān)，但主要機(jī)制在于電子傳遞效率。ROS形成過(guò)程中，電子傳遞效率越高，越容易引起細(xì)胞凋亡，從而抑制癌癥發(fā)生。趙丹等[18]證明聚合度越高，去除自由基的能力越弱。因此，PCs的結(jié)構(gòu)組成和聚合度與抗氧化之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，預(yù)計(jì)2018年在世界范圍內(nèi)肝癌發(fā)病率位居惡性腫瘤第6位，死亡率排在第4位；其中男性患者更是高居發(fā)病率的第5位，死亡率的第2位[21]。從天然動(dòng)植物中尋找可以防治腫瘤的有效成分，可為預(yù)防和治療癌癥提供了新的思路。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究山楂PCs提取物及其主要成分對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用及其對(duì)抗氧化和細(xì)胞凋亡的影響，探究不同PCs的作用功效，為充分合理地利用豐富的膳食PCs資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為肝癌的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SMMC-7721細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動(dòng)物中心提供，人肝HL-7702細(xì)胞購(gòu)于上海羽朵生物科技有限公司。山楂PCs提取物、表兒茶素、PCs B2由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)崔同教授實(shí)驗(yàn)室純化制得，純度大于99%。

RPIM-1640細(xì)胞培養(yǎng)基 美國(guó)HyClone公司；胎牛血清 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶溶液-乙二胺四乙酸北京博奧拓達(dá)科技有限公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 索萊寶生物科技有限公司；超微量Na+K+-ATP酶試劑盒、MDA試劑盒、總SOD試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒，總蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所；半胱天冬酶（Caspase）-3、Caspase-8、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly (ADP-ribose) polymerase，PARP）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、Bcl-2蛋白 美國(guó)Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（H+L）、抗小鼠IgG（H+L） 康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；CKX41熒光倒置顯微鏡 日本奧林巴斯公司；JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；MiniChemi I化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞活力檢測(cè)

根據(jù)本課題組前期研究及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定藥品質(zhì)量濃度（6.25、12.5、25、50、100 μg/mL），選取PCs提取物（主要含有機(jī)酸和PCs類物質(zhì)，包括表兒茶素、PCs B2、PCs B5、PCs C1、PCs三聚體、PCs四聚體、PCs五聚體等）[22]、表兒茶素和PCs B2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞活力檢測(cè)采用MTT法[23]。參考試劑盒說(shuō)明書，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞為105個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96 孔板中（板邊緣孔用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）填充）。細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加入含不同質(zhì)量濃度藥品的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL，對(duì)照組為等體積無(wú)血清、無(wú)藥品培養(yǎng)基，設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48 h后棄去培養(yǎng)液，加入由10 μL MTT溶液和90 μL無(wú)血清培養(yǎng)基組成的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，細(xì)胞底部生成藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚后，小心用移液器吸去上清培養(yǎng)液，加入DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。PCs對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的計(jì)算公式如下，細(xì)胞存活率/%＝100%-細(xì)胞增殖抑制率/%。

1.3.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞為106個(gè)/孔，每孔1 mL接種于6 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含100 μg/mL山楂PCs提取物、表兒茶素和PCs B2的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL，對(duì)照組為等體積無(wú)血清、無(wú)藥品培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3 DAPI染色法觀察細(xì)胞凋亡

參考文獻(xiàn)[24]和試劑盒說(shuō)明書，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞為105個(gè)/孔，接種于24 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，分別加入含50、100、150 μg/mL山楂PCs提取物、表兒茶素和PCs B2的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL，對(duì)照組為等體積無(wú)血清、無(wú)藥品培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，加入PBS漂洗兩次，然后加入DAPI工作液至終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min。洗掉DAPI工作液，用PBS洗2～3 次，每次3～5 min，吸出PBS，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3.4 細(xì)胞酶活力和MDA含量檢測(cè)

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞為105個(gè)/孔，接種于6 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含50、100、150 μg/mL山楂PCs提取物、表兒茶素和PCs B2的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL，對(duì)照組為等體積無(wú)血清、無(wú)藥品培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后用4 ℃預(yù)冷的PBS洗兩次，用細(xì)胞刮板將細(xì)胞刮下，4 ℃離心機(jī)中1 000 r/min離心10 min。去上清液，用生理鹽水洗一遍，再次離心10 min；去上清液，加入300 μL生理鹽水，冰水浴條件下用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎（功率300 W、5 s/次、間隔30 s、重復(fù)3～5 次）。參照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞CAT、SOD、GSH-Px和Na+K+-ATP酶活力和MDA含量。

1.3.5 Western bolt法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

參照文獻(xiàn)[25]的方法，樣品經(jīng)過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗和二抗雜交、ECL Plus顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)成像，以β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2013軟件和SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.001表示差異高度顯著。采用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂PCs對(duì)細(xì)胞增殖的影響

山楂中含有多種多酚類化合物，其中PCs種類多且含量較高。由圖1可知，處理時(shí)間相同（如24 h）時(shí)，山楂PCs提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制率隨質(zhì)量濃度提高而增加，呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量濃度依賴效應(yīng)，質(zhì)量濃度為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的PCs提取物抑制率分別為2.77%、6.40%、10.85%、22.91%、39.19%；表兒茶素和PCs B2也有類似的效應(yīng)。同一質(zhì)量濃度的PCs處理不同時(shí)間，其抑制率隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，表現(xiàn)出時(shí)間依賴性，如25 μg/mL PCs B2處理24 h時(shí)抑制率為16.08%，48 h時(shí)則升至到31.95%，增加了近1 倍。雖然山楂PCs提取物、表兒茶素和PCs B2對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用規(guī)律相近，但是相同質(zhì)量濃度處理相同時(shí)間的不同種PCs對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制效果卻有一定差異，在質(zhì)量濃度低于25 μg/mL時(shí)，PCs B2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果最好，表兒茶素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率最低；而在50、100 μg/mL時(shí)，山楂PCs提取物的細(xì)胞增殖抑制率最高。由此可見(jiàn)，不同種類的PCs可呈濃度和時(shí)間依賴性的對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，且與對(duì)照組（細(xì)胞增殖抑制率為0，未在圖中顯示）相比差異顯著（P＜0.05）。

圖 1 PCs對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of PCs on SMMC-7721 cell proliferation

圖 2 PCs對(duì)HL-7702細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 Effect of PCs on HL-7702 liver cell viability

如圖2所示，采用相同質(zhì)量濃度PCs和時(shí)間處理HL-7702細(xì)胞，與無(wú)藥物處理的細(xì)胞（細(xì)胞存活率為100%，未在圖中顯示）相比，3 種PCs對(duì)HL-7702細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，低質(zhì)量濃度下還略有提高作用，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)選取的PCs質(zhì)量濃度和處理時(shí)間對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒害作用。

2.2 PCs處理SMMC-7721細(xì)胞的形態(tài)變化和細(xì)胞凋亡情況

圖 3 PCs對(duì)SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響（400×）Fig. 3 Effect of PCs on morphology of SMMC-7721 cells (400 ×)

選用對(duì)正常HL-7702細(xì)胞活力無(wú)影響，但對(duì)SMMC-7721細(xì)胞抑制力最強(qiáng)的100 μg/mL 3 種PCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如圖3所示，未加PCs處理的對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)原有的多角形，大小相似、緊密相連、貼壁良好、均勻透亮。山楂PCs提取物、表兒茶素和PCs B2處理組細(xì)胞大小不一、數(shù)量減少，形態(tài)變小、變圓，且出現(xiàn)脫壁漂浮現(xiàn)象，有凋亡小體產(chǎn)生，胞內(nèi)亮度不均，表明細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡狀態(tài)，程度由重到輕依次為山楂PCs提取物、PCs B2和表兒茶素處理組，這與2.1節(jié)MTT法得到的結(jié)果一致。

圖 4 PCs處理SMMC-7721細(xì)胞48 h后DAPI染色結(jié)果Fig. 4 DAPI staining of SMMC-7721 cells after PCs treatment for 48 h

如圖4所示，未經(jīng)處理的對(duì)照組細(xì)胞染色后呈現(xiàn)均勻的暗藍(lán)色熒光，細(xì)胞形態(tài)整齊均一；而用PCs處理后細(xì)胞膜完整性降低、通透性增加，細(xì)胞收縮、核染色質(zhì)固縮，染色后細(xì)胞核局部呈現(xiàn)出比對(duì)照組更強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，凋亡晚期細(xì)胞可看到凋亡小體，這些特征說(shuō)明3 種PCs均可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，且凋亡特征隨著PCs質(zhì)量濃度的增加而越發(fā)明顯，山楂PCs提取物促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的效果優(yōu)于其他兩種，再次印證了前文中得到的結(jié)果。

2.3 PCs對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中MDA含量和抗氧化酶活力的影響

圖 5 PCs處理對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中MDA含量的影響Fig. 5 MDA level in SMMC-7721 cells cultured with PCs

由圖5可知，PCs可以顯著提高SMMC-7721細(xì)胞中MDA含量（P＜0.05），且呈濃度依賴性。山楂PCs提取物處理的細(xì)胞中MDA相對(duì)增加率最高，其次為PCs B2和表兒茶素。與對(duì)照組相比，150 μg/mL山楂PCs提取物、PCs B2和表兒茶素使細(xì)胞中MDA含量分別增加26.11%、21.08%和20.01%。

圖6表明PCs可以顯著降低SMMC-7721細(xì)胞中SOD活力（P＜0.05），且呈濃度依賴性。與對(duì)照組相比，150 μg/mL山楂PCs提取物、PCs B2和表兒茶素分別使細(xì)胞中SOD活力降低23.06%、22.84%和16.10%。

圖 6 PCs處理對(duì)SMMC-7721細(xì)胞SOD活力的影響Fig. 6 SOD activity in SMMC-7721 cells cultured with PCs

圖 7 PCs處理對(duì)SMMC-7721細(xì)胞GSH-Px活力的影響Fig. 7 GSH-Px activity in SMMC-7721 cells cultured with PCs

圖7表明，PCs可以顯著降低SMMC-7721細(xì)胞中GSH-Px活力（P＜0.05），且呈濃度依賴性。3 種PCs的作用效果和規(guī)律與其對(duì)SOD活力的影響表現(xiàn)出高度一致性。與對(duì)照組相比，150 μg/mL山楂PCs提取物、PCs B2和表兒茶素分別使細(xì)胞中GSH-Px活力降低36.97%、34.31%和31.80%。

圖 8 PCs處理對(duì)SMMC-7721細(xì)胞CAT活力的影響Fig. 8 CAT activity in SMMC-7721 cells cultured with PCs

如圖8所示，與對(duì)照組相比，PCs可以顯著降低SMMC-7721細(xì)胞中CAT活力（P＜0.05），且呈濃度依賴性。150 μg/mL山楂PCs提取物、PCs B2和表兒茶素對(duì)細(xì)胞中CAT活力的相對(duì)降低率分別為13.20%、11.05%和9.12%。

2.4 PCs對(duì)SMMC-7721細(xì)胞Na+K+-ATP酶活力的影響

圖9表明，PCs呈濃度依賴性的顯著降低SMMC-7721細(xì)胞中Na+K+-ATP酶的活力（P＜0.05），說(shuō)明細(xì)胞吸鉀排鈉功能和細(xì)胞主動(dòng)運(yùn)輸能力的減弱。3 種PCs中，山楂PCs提取物對(duì)細(xì)胞中Na+K+-ATP酶活力相對(duì)降低率最高，其次為PCs B2和表兒茶素。與對(duì)照組相比，150 μg/mL山楂PCs提取物、PCs B2和表兒茶素對(duì)細(xì)胞中Na+K+-ATP酶活力分別降低21.13%、17.41%和16.01%，這一結(jié)果與2.3節(jié)抗氧化酶活力的變化相似。

圖 9 PCs處理對(duì)SMMC-7721細(xì)胞Na＋ K＋-ATP酶活力的影響Fig. 9 Na+K+-ATPase activity in SMMC-7721 cells cultured with PCs

2.5 PCs對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

圖 10 PCs對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig. 10 Effect of PCs on the expression of apoptosis-related proteins

如圖10所示，PCs對(duì)SMMC-7721細(xì)胞作用后，PCs提取物、PCs B2和表兒茶素都使Caspase-8的表達(dá)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；同時(shí)，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量有增加的趨勢(shì)，而抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)則有降低的趨勢(shì)，說(shuō)明Bax與Bcl-2比值增大。Caspase-3在Caspase-8和Bax、Bcl-2引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，圖10中顯示Caspase-3被活化，產(chǎn)生活化的Caspase-3，導(dǎo)致PARP片段化增加，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3 討 論

目前，大量研究證明PCs提取物具有自由基清除能力和抗氧化活性[26]，對(duì)癌細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用[27]，也有一些實(shí)驗(yàn)表明這與PCs的濃度和結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的相關(guān)性[16-18,28]。實(shí)驗(yàn)表明多種PCs單體都能提高脂質(zhì)抗氧化能力和抗低密度脂蛋白氧化能力[29]；等物質(zhì)的量的多聚PCs、寡聚PCs和黃烷醇單體的抗氧化性依次減弱[28]。Zhang Shuting等[30]用DPPH、總抗氧化能力檢測(cè)和鐵離子還原/抗氧化能力法3 種方法證明了葡萄籽提取物中多聚PCs水解物的自由基清除作用具有濃度效應(yīng)，且與其結(jié)構(gòu)相關(guān)，其抗氧化活性由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋罕韮翰杷貨](méi)食子酸酯根皮酚衍生物＞表兒茶素沒(méi)食子酸酯＞表兒茶素根皮酚衍生物＞兒茶素根皮酚衍生物＞兒茶素＞表兒茶素＞水溶性VE。Wang等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，檳榔籽PCs聚合程度越高，對(duì)細(xì)胞引起的氧化性傷害越大，細(xì)胞凋亡越多。Lizarraga等[19]的研究表明，具有高聚合度和沒(méi)食子酰基化度的葡萄籽PCs較松樹皮中低聚合度和低沒(méi)食子?；鹊腜Cs具有更高的ROS清除能力和誘導(dǎo)人腸癌HT29細(xì)胞凋亡的作用。上述研究證明PCs抗氧化活性可能與聚合物中單體的數(shù)目、羥基的數(shù)量和沒(méi)食子?；鹊戎笜?biāo)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度和組成的PCs對(duì)細(xì)胞的作用具有差異：在樣品質(zhì)量濃度為6.25、12.5 μg/mL及25 μg/mL時(shí)，PCs B2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果較好；而樣品在50 μg/mL及100 μg/mL時(shí)，山楂PCs提取物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果最好，PCs的癌細(xì)胞增殖抑制作用和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡作用順序?yàn)椋荷介玃Cs提取物＞PCs B2＞表兒茶素，且與質(zhì)量濃度和時(shí)間成正比。本研究所用山楂PCs提取物含有多種活性成分[22]，主要是有機(jī)酸、表兒茶素、PCs B2、PCs B5、PCs C1和綠原酸等，故而其活性較PCs B2和表兒茶素更好。雖然還不能明確地判定PCs的聚合度和其活性之間的關(guān)系，但也基本體現(xiàn)了總體趨勢(shì)。

PCs處理SMMC-7721細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖受到了抑制。本研究通過(guò)對(duì)PCs作用后的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察和DAPI染色，發(fā)現(xiàn)PCs作用于SMMC-7721細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生凋亡，表明PCs對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。PCs作用于SMMC-7721細(xì)胞后，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征。進(jìn)一步用DAPI染色后，可以看到細(xì)胞收縮、核染色質(zhì)固縮，染色后細(xì)胞核局部呈現(xiàn)出比對(duì)照組更為強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，凋亡晚期細(xì)胞可看到凋亡小體。但100 μg/mL PCs處理后的SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后，明亮藍(lán)色熒光最多，考慮可能是150 μg/mL PCs處理后細(xì)胞凋亡脫落，被PBS洗脫。故用150 μg/mL PCs處理SMMC-7721細(xì)胞后，DAPI染色出現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光反而較少。

正常情況下，機(jī)體內(nèi)存在的抗氧化酶如SOD和非酶的抗氧化物如VE通過(guò)清除體內(nèi)氧化物質(zhì)維持機(jī)體正常生理功能[32]。但當(dāng)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)損壞、遭遇外源物質(zhì)脅迫時(shí)，氧化物質(zhì)的產(chǎn)生和清除的平衡被打破，氧化物質(zhì)含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致DNA損傷，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生紊亂，細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物PCs可以使肝癌細(xì)胞的MDA含量和ROS水平降低，增強(qiáng)SOD活力。許慧[33]證明加入蓮房PCs后，會(huì)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS積蓄，導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷及線粒體膜電位的損失，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，山楂PCs會(huì)增加SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)MDA含量，使細(xì)胞中SOD、CAT和GSH-Px活力降低。推測(cè)PCs可通過(guò)降低抗氧化酶活力，導(dǎo)致過(guò)氧化物質(zhì)清除率降低，最終致使胞內(nèi)MDA含量升高，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但PCs對(duì)癌細(xì)胞中氧化物質(zhì)含量和抗氧化酶活力的分子調(diào)控機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

Na+K+-ATP酶位于細(xì)胞膜上，具有載體蛋白和ATP水解酶的活力，通過(guò)酶構(gòu)象的變化水解ATP，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞吸鉀排鈉，與膜兩側(cè)的膜電位穩(wěn)定、調(diào)節(jié)滲透壓和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。研究顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤和乳腺癌等多種細(xì)胞株中，Na+K+-ATP酶呈現(xiàn)高水平表達(dá)[34-35]。Lefranc等[34]利用RNA干擾技術(shù)敲低神經(jīng)膠質(zhì)瘤U372-MG細(xì)胞中Na+K+-ATP酶α1亞單位的表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性。腫瘤細(xì)胞中高活性Na+K+-ATP酶可為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)提供充足的能量，促進(jìn)細(xì)胞增殖；反之，可以抑制細(xì)胞增殖。強(qiáng)心甾類固醇作為Na+K+-ATP酶抑制劑，通過(guò)抑制酶活力抑制腫瘤細(xì)胞能量來(lái)源并抑制Na+K+-ATP酶相關(guān)信號(hào)通路，達(dá)到抗腫瘤作用。本研究證明山楂PCs可以抑制Na+K+-ATP酶活力，這很可能是引起細(xì)胞凋亡的原因之一。

Papademetrio等[36]的研究指出，兒茶素可以通過(guò)使細(xì)胞線粒體膜電位損失、下調(diào)生存素蛋白和Bcl-2表達(dá)、增加促凋亡蛋白Bax表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗癌的目的。Roy等[25]的研究證明，葡萄籽PCs依賴于p53蛋白，并通過(guò)Bcl-2、Bax和Caspase 3 種途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)PCs可能通過(guò)兩種途徑使細(xì)胞凋亡，即細(xì)胞外部信號(hào)觸發(fā)的凋亡——死亡受體途徑和細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)觸發(fā)的凋亡——線粒體途徑。死亡受體途徑中細(xì)胞膜表面死亡受體會(huì)在細(xì)胞受到凋亡刺激后發(fā)生相應(yīng)的變化，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體，隨后其死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域和Caspase-8相互作用，活化的Caspase-8進(jìn)一步激活如Caspase-3等Caspase，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞發(fā)生凋亡；線粒體途徑中線粒體跨膜電位的下降和細(xì)胞色素c的釋放使Caspase-9被激活，活化型的Caspase-9激活下游的Caspases，進(jìn)而作用于PARP，使其發(fā)生片段化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白對(duì)調(diào)節(jié)線粒體膜電位發(fā)揮了重要作用，通過(guò)它們對(duì)線粒體膜電位的改變，促使線粒體內(nèi)部的細(xì)胞色素c釋放到胞質(zhì)中，從而使Caspase被激活并發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[37-39]。本研究也證明PCs可增加Caspase-8的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的同時(shí)下調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2，使活化的Caspase-3和片段化的PARP表達(dá)增多，最終誘導(dǎo)死亡受體調(diào)節(jié)的外源凋亡途徑和線粒體調(diào)節(jié)的內(nèi)源凋亡途徑。

盡管植物來(lái)源的PCs類物質(zhì)在體外具有很強(qiáng)的抗氧化性，能夠強(qiáng)烈抑制腫瘤細(xì)胞增殖，通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶活力和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但PCs被機(jī)體吸收程度很有限，以完整形式吸收的二聚體至多聚體只占吸收的(-)-表兒茶素的10%，血液和尿液中PCs單體也并非來(lái)自人體吸收的寡聚體和多聚體[40]；因此，多聚體能否在體內(nèi)呈現(xiàn)生理活性有待探討。但PCs可以被腸道微生物降解形成植物甾體苯戊烯醇酮和酚酸，降解后產(chǎn)物的吸收和對(duì)機(jī)體的作用可能與PCs在人體中的作用情況更相符[41]；另一方面，PCs也可以改變腸道微生物種類和代謝，進(jìn)而影響人體健康。因此，腸道微生物和PCs的相互作用更應(yīng)該得到人們的關(guān)注[40]。

綜上，山楂PCs提取物、PCs B2和表兒茶素都可以通過(guò)影響抗氧化酶、Na+K+-ATP酶活力來(lái)降低細(xì)胞的自我保護(hù)能力，同時(shí)進(jìn)一步觸發(fā)不同凋亡途徑，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而起到抑制腫瘤的效果；山楂PCs的生物活性與質(zhì)量濃度和處理時(shí)間呈正相關(guān)，與其聚合度和分子結(jié)構(gòu)也具有一定相關(guān)性。