呂振宇，孟 姣，孫傳鑫，陳 暢*

（中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101）

枸杞是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，其果實(shí)為枸杞子，屬于枸杞屬（Lycium），主要包括寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）和中華枸杞（Lycium chinense Mill.）。枸杞子性平味甘，藥用成分多樣，具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目、延緩衰老等眾多功效?！侗静菥V目》中記載枸杞子“久服堅(jiān)筋骨，輕身不老，耐寒暑”。

衰老是一個(gè)生理功能持續(xù)退化，器官功能損傷，對(duì)疾病敏感性增加的一個(gè)過程，基于衰老的自由基學(xué)說，衰老與細(xì)胞的氧化損傷密不可分。作為天然抗氧化劑，枸杞的抗氧化、抗衰老功能受到了科學(xué)家的廣泛關(guān)注[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，枸杞可以通過下調(diào)生長(zhǎng)抑制因子p53和p16的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而延緩細(xì)胞復(fù)制性衰老[4-5]。枸杞可以抑制衰老、高脂飲食、缺氧、過量運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[6-10]，上調(diào)各組織中抗氧化酶的活性，提高抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過氧化水平[11-12]。在臨床應(yīng)用方面也有研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)30 d飲用枸杞飲料可以提高老人血清中抗氧化酶（超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶）的水平，下調(diào)脂質(zhì)過氧化水平，從而提高機(jī)體抗氧化能力[13-14]。雖然已經(jīng)有很多研究證實(shí)了枸杞的抗氧化作用，但對(duì)于其作用的具體機(jī)制還不清楚。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是經(jīng)典的模式生物，具有易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)周期短、后代數(shù)量多等特點(diǎn)，這賦予其在衰老功能研究方面的極大優(yōu)勢(shì)[15-16]。本研究以秀麗隱桿線蟲（以下簡(jiǎn)稱線蟲）為模型，分析了枸杞總提取物對(duì)線蟲壽命及產(chǎn)卵能力的影響，并進(jìn)一步探討了其抗氧化能力，從亞細(xì)胞水平解釋了枸杞的抗氧化作用機(jī)制，為其開發(fā)利用與應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞果實(shí)分別取自寧夏中寧、青海和甘肅。

線蟲品系B r i s t o l N 2來自于明尼蘇達(dá)大學(xué)Caenorhabditis elegans Genetics Center；線蟲品系Pmyo3::HyPer、roGFP2::Orp1由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，其含有HyPer、Orp1的質(zhì)粒由德國(guó)癌癥研究中心的Tobias P.Dick教授惠贈(zèng)。

蛋白胨 美國(guó)BD公司；2’,7’-二氯-二氫熒光素乙酰乙酸鹽（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；線粒體超氧化物紅色熒光探針MitoSox Red、TRIzol試劑美國(guó)Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶抑制劑 美國(guó)Promega公司；SYBR Green熒光染料南京諾唯贊生物科技有限公司；抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水溶性VE（Trolox）、三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、膽固醇 美國(guó)Sigma公司；瓊脂粉、白藜蘆醇、Oligo（dT）、dNTP 生工生物工程（上海）股份有限公司；DEPC水 上海翊圣生物科技有限公司；冰醋酸、醋酸鈉、三氯化鐵、氯化鈣、無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、次氯酸鈉溶液 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

普通體視顯微鏡 日本Olympus公司；恒溫生化培養(yǎng)箱武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城有限公司；生物潔凈工作臺(tái) 海爾股份有限公司；離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；LSM750激光共聚焦顯微鏡、熒光體視鏡 德國(guó)Zeiss公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞提取物的制備

稱取采集到的寧夏中寧、青海、甘肅3 個(gè)產(chǎn)地枸杞果實(shí)100 g，蒸餾水清洗5 次，室溫下在1 L蒸餾水（pH 7）中浸泡12 h，加入2 L蒸餾水煎煮2.0 h，之后再加入2 L蒸餾水繼續(xù)煎煮1.5 h。采用空心纖維膜趁熱過濾煎煮過的枸杞液，合并兩次所得濾液進(jìn)行濃縮（1 kPa、45 ℃），最終獲得100 mL濃縮液（-20 ℃儲(chǔ)存）。提取獲得的枸杞水煎液質(zhì)量濃度為1 g/mL，成分主要包括枸杞多糖、枸杞黃酮、枸杞色素等水溶性成分。青海枸杞和甘肅枸杞采用同樣的流程獲得水煎液。

1.3.2 線蟲培養(yǎng)

所有線蟲均采用接種有大腸桿菌OP50的標(biāo)準(zhǔn)NGM瓊脂平板在20 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。枸杞提取物依據(jù)不同的稀釋質(zhì)量濃度與大腸桿菌OP50混合涂布于NGM平板上。同步化后L4時(shí)期的線蟲分別放置于對(duì)照或混合有枸杞提取物的NGM平板上培養(yǎng)。

1.3.3 線蟲同步化

為了保證實(shí)驗(yàn)過程中線蟲生長(zhǎng)時(shí)期基本一致，需要對(duì)線蟲進(jìn)行同步化。培養(yǎng)線蟲至成蟲，以體內(nèi)含有較多蟲卵為佳。使用M9緩沖液將線蟲從培養(yǎng)板上洗下，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，并用M9緩沖液將液體體積補(bǔ)充至12 mL，2 000×g離心2 min，小心去除上清液，使用M9緩沖液重懸洗滌1 次。離心去除上清液后，在管中加入4 mL Bleach液，不斷搖晃并鏡檢觀察，約5～6 min后，大部分蟲體斷裂，釋放出蟲卵。立即使用M9緩沖液補(bǔ)充管內(nèi)液體體積至12 mL，終止反應(yīng)。2 000×g離心2 min，去除上清液，用M9緩沖液重新懸浮，洗滌3 次。離心去除上清液后，在管中加入4 mL M9緩沖液，20 ℃恒溫200 r/min培養(yǎng)過夜，保證蟲卵孵化。此時(shí)線蟲均同步化在L1期。

1.3.4 體外抗氧化能力檢測(cè)

采用亞鐵離子還原/抗氧化能力（ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）法[17-18]檢測(cè)3 種枸杞提取物的總抗氧化能力。其原理為在酸性條件下，淡黃色的Fe3+-TPTZ可被樣品中還原性物質(zhì)還原為藍(lán)色的Fe2+-TPTZ形式，于593 nm波長(zhǎng)處具有最大吸光度，在Fe3+-TPTZ過量的情況下，檢測(cè)藍(lán)色物質(zhì)的生成量可以反映樣品的總抗氧化能力。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再求得樣品相應(yīng)Trolox的濃度（mmol/L），定義為FRAP值，F(xiàn)RAP值越大，抗氧化活性越強(qiáng)。因此將新配制的190 μL TPTZ工作液置于96 孔酶標(biāo)板中預(yù)熱到37 ℃，于593 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度（A1），加入10 μL稀釋枸杞提取物樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、雙蒸水（空白對(duì)照）并混勻，反應(yīng)5 min后于593 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度（A2），以A1與A2的差值作為最終的吸光度。最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各樣品的FRAP。

用M9緩沖液將線蟲從培養(yǎng)板上洗下，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，采用活性氧（reactive oxygen species，ROS）-敏感染料DCFH-DA、線粒體紅色熒光探針（MitoSox Red）進(jìn)行檢測(cè)。線蟲在含有20 μmol/L DCFH-DA或1 μmol/L MitoSox Red的M9緩沖液中20 ℃處理30 min，2 000×g離心2 min，去除上清液，用M9緩沖液重新懸浮，洗滌3 次。然后用200 μL M9重懸，轉(zhuǎn)移到黑色96 孔酶標(biāo)板中，立即在全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè)，DCFH-DA的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為485 nm和535 nm，MitoSox Red的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為510 nm和580 nm。

1.3.6 線蟲體內(nèi)抗氧化物酶基因表達(dá)水平的測(cè)定

用M9緩沖液將線蟲從培養(yǎng)板上洗下，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入1 mL TRIzol試劑，根據(jù)說明書提取總RNA，之后采用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)mRNA的相對(duì)水平，具體流程如下：樣品加熱到95 ℃，停留2 min，接下來進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)（變性94 ℃，1 min；退火58 ℃，1 min；延伸72 ℃，1 min），72 ℃延伸10 min。引物序列如下：sod-1上游引物：5′-CGTAGGCGATCTAGGAAATGTG-3′、下游引物：5′-AACAACCATAGATCGGCCAACG-3′；sod-2上游引物：5′-AGCTTTCGGCATCAACTGTC-3′、下游引物：5′-AAGTCCAGTTGTTGCCTCAAGT-3′；gcs-1上游引物：5′-GTGCAAGTGTCGACGATCGTAC-3′、下游引物：5′-GCGAATATGTTTTGCCAGTGGCTC-3′。

1.3.7 線蟲產(chǎn)卵計(jì)數(shù)

挑取20 只L4時(shí)期的線蟲分別放置于10 組對(duì)照和枸杞接種的NGM平板上培養(yǎng)，之后每天將線蟲挑取至新平板后統(tǒng)計(jì)蟲卵數(shù)量到線蟲不再產(chǎn)卵為止。

1.3.8 線蟲壽命統(tǒng)計(jì)

線蟲同步化后L4時(shí)期的線蟲分別挑取50 只放置于對(duì)照或枸杞接種的NGM平板上培養(yǎng)，之后每天統(tǒng)計(jì)死亡線蟲的數(shù)量直到全部線蟲死亡為止。

1.3.9 細(xì)胞質(zhì)H2O2水平的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用兩種轉(zhuǎn)基因（P m y o 3::H y P e r和roGFP2::Orp1）線蟲為模型檢測(cè)不同枸杞提取物對(duì)線蟲胞質(zhì)中H2O2的清除能力，將同步化后L4時(shí)期的兩種轉(zhuǎn)基因線蟲分別放置于對(duì)照或混合有枸杞提取物的NGM平板上培養(yǎng)。4 d后用M9緩沖液將線蟲轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，用M9緩沖液洗滌3 次。然后用200 μL M9緩沖液重懸后轉(zhuǎn)移到黑色96 孔酶標(biāo)板中并檢測(cè)。HyPer和Orp1探針特異性感知胞質(zhì)氧化還原狀態(tài)，HyPer探針氧化態(tài)和還原態(tài)的激發(fā)光波長(zhǎng)分別為488 nm和405 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為530 nm，以480 nm與405 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度的比值表示胞質(zhì)H2O2相對(duì)含量。Orp1探針氧化態(tài)和還原態(tài)的激發(fā)光波長(zhǎng)分別為405 nm和488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)同為530 nm，以405 nm與488 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度的比值表示胞質(zhì)H2O2的相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地枸杞體外抗氧化能力評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)利用FRAP法[19]體外檢測(cè)比較不同產(chǎn)地枸杞抗氧化能力的差異，同時(shí)以Trolox為對(duì)照評(píng)估枸杞樣品質(zhì)量濃度與抗氧化力之間的關(guān)系。

表 1 不同產(chǎn)地枸杞提取物體外總抗氧化能力（n＝3）Table 1 Total antioxidant capacity of Goji berries at different concentrations (n= 3)

由表1可知，3 個(gè)產(chǎn)地的枸杞均具有很強(qiáng)的體外抗氧化能力，它們之間沒有顯著差異。隨著枸杞質(zhì)量濃度的提高，其抗氧化能力梯度增加，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇枸杞質(zhì)量濃度50 mg/mL做進(jìn)一步研究。

2.2 枸杞對(duì)線蟲體內(nèi)ROS和抗氧化酶水平的影響

枸杞在體外有明顯的抗氧化作用，為深入探究寧夏中寧枸杞在生物體內(nèi)的抗氧化作用，本實(shí)驗(yàn)采用ROS-敏感染料DCFH-DA檢測(cè)枸杞對(duì)線蟲體內(nèi)ROS水平的影響。由表2可知，枸杞可以降低線蟲體內(nèi)的ROS水平。同時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，枸杞可以提高抗氧化物酶基因sod-1、sod-2、gcs-1的相對(duì)表達(dá)水平。

表 2 枸杞對(duì)線蟲體內(nèi)ROS水平和抗氧化物酶基因相對(duì)表達(dá)水平的影響（n＝3）Table 2 Effect of Goji berries on the level of ROS and the relative expression of antioxidant enzymes in C. elegans (n= 3)

2.3 枸杞對(duì)線蟲壽命的影響

圖 1 枸杞對(duì)線蟲壽命的影響Fig. 1 Effect of Goji berries on the lifespan of C. elegans

為了深入闡述枸杞在延緩衰老和延長(zhǎng)壽命方面的功效，以野生型N2線蟲為模型統(tǒng)計(jì)了中寧枸杞對(duì)線蟲壽命的影響。已有研究報(bào)道白藜蘆醇可以延長(zhǎng)線蟲壽命[20-21]，本實(shí)驗(yàn)以白藜蘆醇為陽性對(duì)照，分析了枸杞對(duì)線蟲壽命的影響，發(fā)現(xiàn)與陽性對(duì)照相比，枸杞對(duì)線蟲的最長(zhǎng)壽命沒有顯著延長(zhǎng)作用（圖1）。

2.4 枸杞對(duì)線蟲產(chǎn)卵能力的影響

中醫(yī)理論中，枸杞具有“益精補(bǔ)腎”的傳統(tǒng)功效，很多研究也發(fā)現(xiàn)枸杞多糖在保護(hù)生殖系統(tǒng)方面具有重要作用[22-23]。有臨床研究顯示，每日服用枸杞子50 g，連續(xù)10 d，可使男性血中睪酮含量顯著升高，從而改善精子運(yùn)動(dòng)能力，可以用于治療弱精子癥[24]，而且枸杞多糖能夠促進(jìn)大鼠睪丸支持細(xì)胞體外增殖[25]。為了探索中寧枸杞是否在改善線蟲生殖方面具有一定的功效，以野生型N2線蟲為模型統(tǒng)計(jì)了枸杞對(duì)線蟲產(chǎn)卵數(shù)量的影響。經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)枸杞對(duì)線蟲的產(chǎn)卵總數(shù)、開始產(chǎn)卵的時(shí)間、結(jié)束產(chǎn)卵的時(shí)間以及產(chǎn)卵高峰期都沒有明顯的改變（圖2、3）。

圖 2 枸杞對(duì)線蟲產(chǎn)卵總數(shù)的影響Fig. 2 Effect of Goji berries on the total number of eggs laid by C. elegans

圖 3 枸杞對(duì)線蟲日產(chǎn)卵數(shù)的影響Fig. 3 Effect of Goji berries on the number of daily eggs laid by C. elegans

2.5 枸杞通過清除線粒體超氧陰離子在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用

雖然有研究分析了枸杞多糖對(duì)體外活性氧自由基的清除作用[26]，但枸杞對(duì)細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器中ROS的清除作用鮮有報(bào)道。利用帶有熒光標(biāo)記可以感知胞質(zhì)中H2O2水平的Pmyo3::HyPer[27]和roGFP2::Orp1[28]兩種轉(zhuǎn)基因線蟲為模型，檢測(cè)了枸杞提取物對(duì)胞質(zhì)中H2O2的清除能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，枸杞總提取物對(duì)細(xì)胞質(zhì)中H2O2水平都沒有顯著的影響。利用·特異的熒光探針MitoSox Red進(jìn)一步檢測(cè)了枸杞提取物對(duì)野生型線蟲體內(nèi)·水平的影響，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組，枸杞提取物可以顯著降低·水平（表3）。因此，枸杞提取物的抗氧化能力很可能是通過清除細(xì)胞線粒體中·來實(shí)現(xiàn)的。

表 3 枸杞對(duì)細(xì)胞中線粒體和胞質(zhì)ROS的清除能力（n＝3）Table 3 ROS scavenging effect of Goji berries in mitochondria and cytoplasm (n= 3)

3 討 論

衰老是指隨著時(shí)間推移，生物的生理結(jié)構(gòu)完整性喪失，導(dǎo)致退行性病變和機(jī)能衰退，適應(yīng)性和抵抗力減退，死亡率增加的過程[29]。衰老伴隨著機(jī)體各個(gè)組織器官的老化和退行性病變，與腫瘤、心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等一系列嚴(yán)重威脅人類健康的疾病密切相關(guān)。由于衰老對(duì)人類健康和生命造成了巨大威脅，探索衰老的機(jī)制、尋求延緩衰老的方法既是一個(gè)古老的問題，又是一個(gè)嶄新的科研領(lǐng)域。為了驗(yàn)證并深入探索《本草綱目》中記載的“枸杞子久服可輕身不老”的功效，以線蟲為動(dòng)物模型開展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，雖然結(jié)果顯示枸杞提取物對(duì)線蟲的最長(zhǎng)壽命和產(chǎn)卵能力沒有顯著影響，但這與其抗衰老功效并不矛盾，而且這與前人研究發(fā)現(xiàn)枸杞對(duì)果蠅和小鼠的最長(zhǎng)壽命沒有顯著影響是一致的[3]，因?yàn)榭顾ダ喜⒉坏韧谘娱L(zhǎng)最長(zhǎng)壽命。隨著科技進(jìn)步，人們對(duì)于衰老機(jī)制的認(rèn)識(shí)越來越深入，目前關(guān)于誘導(dǎo)衰老的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：基因組不穩(wěn)定性、端?？s短、表觀遺傳學(xué)改變、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)喪失、營(yíng)養(yǎng)敏感度降低、線粒體功能障礙、細(xì)胞衰老、干細(xì)胞耗竭和細(xì)胞間通訊改變等[29]。這些機(jī)制從各個(gè)方面闡述了衰老誘導(dǎo)的機(jī)體變化和抵抗衰老效應(yīng)的可能方法，所以枸杞可能是通過調(diào)控細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)或線粒體功能等來發(fā)揮促進(jìn)健康衰老功效的，這還有待于進(jìn)一步深入研究。

自由基衰老學(xué)說是經(jīng)典的衰老學(xué)說之一，其認(rèn)為自由基過度積累導(dǎo)致DNA損傷或蛋白質(zhì)等大分子氧化損傷是導(dǎo)致衰老的重要原因，所以抗氧化被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)抗衰老的重要方法。事實(shí)上，只有自由基的產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)嚴(yán)重失衡時(shí)才會(huì)導(dǎo)致組織的損傷。適量自由基的產(chǎn)生不僅為機(jī)體提供和傳遞能量，還是體內(nèi)多種代謝和信號(hào)通路的啟動(dòng)者和調(diào)節(jié)者，參與體內(nèi)炎癥免疫、代謝、細(xì)胞增殖、組織再生修復(fù)等各種生命過程的調(diào)節(jié)。而且細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器的氧化還原狀態(tài)是不同的，細(xì)胞質(zhì)和線粒體是偏還原態(tài)的，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是偏氧化態(tài)的，最近的研究也發(fā)現(xiàn)隨著衰老過程的發(fā)生，細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向還原狀態(tài)轉(zhuǎn)變，而細(xì)胞質(zhì)和線粒體則向氧化態(tài)轉(zhuǎn)變[30]。所以，深入研究枸杞在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化能力的機(jī)制需要具體研究其作用的細(xì)胞器。本實(shí)驗(yàn)利用感受不同細(xì)胞器中ROS的熒光探針，檢測(cè)了枸杞對(duì)細(xì)胞質(zhì)和線粒體中ROS的清除能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，枸杞可以降低線粒體中O2-·的水平，主要在線粒體中發(fā)揮抗氧化作用。前期研究也發(fā)現(xiàn)枸杞在阿爾茨海默病模式線蟲中可以調(diào)控線粒體應(yīng)激反應(yīng)[31]，這也提示了枸杞在線粒體中的重要功能。因此，枸杞在線粒體中的抗氧化作用可能是其抗衰老作用的一種機(jī)制。