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        枸杞對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命和產(chǎn)卵的影響及其抗氧化作用

        2019-04-02 03:42:52呂振宇孫傳鑫
        食品科學(xué) 2019年5期
        關(guān)鍵詞:能力

        呂振宇,孟 姣,孫傳鑫,陳 暢*

        (中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所,北京 100101)

        枸杞是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥,其果實(shí)為枸杞子,屬于枸杞屬(Lycium),主要包括寧夏枸杞(Lycium barbarum L.)和中華枸杞(Lycium chinense Mill.)。枸杞子性平味甘,藥用成分多樣,具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目、延緩衰老等眾多功效?!侗静菥V目》中記載枸杞子“久服堅(jiān)筋骨,輕身不老,耐寒暑”。

        衰老是一個(gè)生理功能持續(xù)退化,器官功能損傷,對(duì)疾病敏感性增加的一個(gè)過程,基于衰老的自由基學(xué)說,衰老與細(xì)胞的氧化損傷密不可分。作為天然抗氧化劑,枸杞的抗氧化、抗衰老功能受到了科學(xué)家的廣泛關(guān)注[1-3]。研究發(fā)現(xiàn),枸杞可以通過下調(diào)生長(zhǎng)抑制因子p53和p16的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖,從而延緩細(xì)胞復(fù)制性衰老[4-5]。枸杞可以抑制衰老、高脂飲食、缺氧、過量運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[6-10],上調(diào)各組織中抗氧化酶的活性,提高抗氧化能力,抑制脂質(zhì)過氧化水平[11-12]。在臨床應(yīng)用方面也有研究發(fā)現(xiàn),連續(xù)30 d飲用枸杞飲料可以提高老人血清中抗氧化酶(超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶)的水平,下調(diào)脂質(zhì)過氧化水平,從而提高機(jī)體抗氧化能力[13-14]。雖然已經(jīng)有很多研究證實(shí)了枸杞的抗氧化作用,但對(duì)于其作用的具體機(jī)制還不清楚。秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)是經(jīng)典的模式生物,具有易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)周期短、后代數(shù)量多等特點(diǎn),這賦予其在衰老功能研究方面的極大優(yōu)勢(shì)[15-16]。本研究以秀麗隱桿線蟲(以下簡(jiǎn)稱線蟲)為模型,分析了枸杞總提取物對(duì)線蟲壽命及產(chǎn)卵能力的影響,并進(jìn)一步探討了其抗氧化能力,從亞細(xì)胞水平解釋了枸杞的抗氧化作用機(jī)制,為其開發(fā)利用與應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        枸杞果實(shí)分別取自寧夏中寧、青海和甘肅。

        線蟲品系B r i s t o l N 2來自于明尼蘇達(dá)大學(xué)Caenorhabditis elegans Genetics Center;線蟲品系Pmyo3::HyPer、roGFP2::Orp1由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建,其含有HyPer、Orp1的質(zhì)粒由德國(guó)癌癥研究中心的Tobias P.Dick教授惠贈(zèng)。

        蛋白胨 美國(guó)BD公司;2’,7’-二氯-二氫熒光素乙酰乙酸鹽(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA) 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;線粒體超氧化物紅色熒光探針MitoSox Red、TRIzol試劑美國(guó)Invitrogen公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶抑制劑 美國(guó)Promega公司;SYBR Green熒光染料南京諾唯贊生物科技有限公司;抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水溶性VE(Trolox)、三吡啶基三嗪(tripyridyltriazine,TPTZ)、膽固醇 美國(guó)Sigma公司;瓊脂粉、白藜蘆醇、Oligo(dT)、dNTP 生工生物工程(上海)股份有限公司;DEPC水 上海翊圣生物科技有限公司;冰醋酸、醋酸鈉、三氯化鐵、氯化鈣、無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、次氯酸鈉溶液 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        普通體視顯微鏡 日本Olympus公司;恒溫生化培養(yǎng)箱武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司;恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城有限公司;生物潔凈工作臺(tái) 海爾股份有限公司;離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;LSM750激光共聚焦顯微鏡、熒光體視鏡 德國(guó)Zeiss公司;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀、多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher公司。

        1.3 方法

        1.3.1 枸杞提取物的制備

        稱取采集到的寧夏中寧、青海、甘肅3 個(gè)產(chǎn)地枸杞果實(shí)100 g,蒸餾水清洗5 次,室溫下在1 L蒸餾水(pH 7)中浸泡12 h,加入2 L蒸餾水煎煮2.0 h,之后再加入2 L蒸餾水繼續(xù)煎煮1.5 h。采用空心纖維膜趁熱過濾煎煮過的枸杞液,合并兩次所得濾液進(jìn)行濃縮(1 kPa、45 ℃),最終獲得100 mL濃縮液(-20 ℃儲(chǔ)存)。提取獲得的枸杞水煎液質(zhì)量濃度為1 g/mL,成分主要包括枸杞多糖、枸杞黃酮、枸杞色素等水溶性成分。青海枸杞和甘肅枸杞采用同樣的流程獲得水煎液。

        1.3.2 線蟲培養(yǎng)

        所有線蟲均采用接種有大腸桿菌OP50的標(biāo)準(zhǔn)NGM瓊脂平板在20 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。枸杞提取物依據(jù)不同的稀釋質(zhì)量濃度與大腸桿菌OP50混合涂布于NGM平板上。同步化后L4時(shí)期的線蟲分別放置于對(duì)照或混合有枸杞提取物的NGM平板上培養(yǎng)。

        1.3.3 線蟲同步化

        為了保證實(shí)驗(yàn)過程中線蟲生長(zhǎng)時(shí)期基本一致,需要對(duì)線蟲進(jìn)行同步化。培養(yǎng)線蟲至成蟲,以體內(nèi)含有較多蟲卵為佳。使用M9緩沖液將線蟲從培養(yǎng)板上洗下,轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,并用M9緩沖液將液體體積補(bǔ)充至12 mL,2 000×g離心2 min,小心去除上清液,使用M9緩沖液重懸洗滌1 次。離心去除上清液后,在管中加入4 mL Bleach液,不斷搖晃并鏡檢觀察,約5~6 min后,大部分蟲體斷裂,釋放出蟲卵。立即使用M9緩沖液補(bǔ)充管內(nèi)液體體積至12 mL,終止反應(yīng)。2 000×g離心2 min,去除上清液,用M9緩沖液重新懸浮,洗滌3 次。離心去除上清液后,在管中加入4 mL M9緩沖液,20 ℃恒溫200 r/min培養(yǎng)過夜,保證蟲卵孵化。此時(shí)線蟲均同步化在L1期。

        1.3.4 體外抗氧化能力檢測(cè)

        采用亞鐵離子還原/抗氧化能力(ferric reducing/antioxidant power,F(xiàn)RAP)法[17-18]檢測(cè)3 種枸杞提取物的總抗氧化能力。其原理為在酸性條件下,淡黃色的Fe3+-TPTZ可被樣品中還原性物質(zhì)還原為藍(lán)色的Fe2+-TPTZ形式,于593 nm波長(zhǎng)處具有最大吸光度,在Fe3+-TPTZ過量的情況下,檢測(cè)藍(lán)色物質(zhì)的生成量可以反映樣品的總抗氧化能力。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,再求得樣品相應(yīng)Trolox的濃度(mmol/L),定義為FRAP值,F(xiàn)RAP值越大,抗氧化活性越強(qiáng)。因此將新配制的190 μL TPTZ工作液置于96 孔酶標(biāo)板中預(yù)熱到37 ℃,于593 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度(A1),加入10 μL稀釋枸杞提取物樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、雙蒸水(空白對(duì)照)并混勻,反應(yīng)5 min后于593 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度(A2),以A1與A2的差值作為最終的吸光度。最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各樣品的FRAP。

        用M9緩沖液將線蟲從培養(yǎng)板上洗下,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,采用活性氧(reactive oxygen species,ROS)-敏感染料DCFH-DA、線粒體紅色熒光探針(MitoSox Red)進(jìn)行檢測(cè)。線蟲在含有20 μmol/L DCFH-DA或1 μmol/L MitoSox Red的M9緩沖液中20 ℃處理30 min,2 000×g離心2 min,去除上清液,用M9緩沖液重新懸浮,洗滌3 次。然后用200 μL M9重懸,轉(zhuǎn)移到黑色96 孔酶標(biāo)板中,立即在全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè),DCFH-DA的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為485 nm和535 nm,MitoSox Red的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為510 nm和580 nm。

        1.3.6 線蟲體內(nèi)抗氧化物酶基因表達(dá)水平的測(cè)定

        用M9緩沖液將線蟲從培養(yǎng)板上洗下,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,加入1 mL TRIzol試劑,根據(jù)說明書提取總RNA,之后采用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)mRNA的相對(duì)水平,具體流程如下:樣品加熱到95 ℃,停留2 min,接下來進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)(變性94 ℃,1 min;退火58 ℃,1 min;延伸72 ℃,1 min),72 ℃延伸10 min。引物序列如下:sod-1上游引物:5′-CGTAGGCGATCTAGGAAATGTG-3′、下游引物:5′-AACAACCATAGATCGGCCAACG-3′;sod-2上游引物:5′-AGCTTTCGGCATCAACTGTC-3′、下游引物:5′-AAGTCCAGTTGTTGCCTCAAGT-3′;gcs-1上游引物:5′-GTGCAAGTGTCGACGATCGTAC-3′、下游引物:5′-GCGAATATGTTTTGCCAGTGGCTC-3′。

        1.3.7 線蟲產(chǎn)卵計(jì)數(shù)

        挑取20 只L4時(shí)期的線蟲分別放置于10 組對(duì)照和枸杞接種的NGM平板上培養(yǎng),之后每天將線蟲挑取至新平板后統(tǒng)計(jì)蟲卵數(shù)量到線蟲不再產(chǎn)卵為止。

        1.3.8 線蟲壽命統(tǒng)計(jì)

        線蟲同步化后L4時(shí)期的線蟲分別挑取50 只放置于對(duì)照或枸杞接種的NGM平板上培養(yǎng),之后每天統(tǒng)計(jì)死亡線蟲的數(shù)量直到全部線蟲死亡為止。

        1.3.9 細(xì)胞質(zhì)H2O2水平的檢測(cè)

        本實(shí)驗(yàn)采用兩種轉(zhuǎn)基因(P m y o 3::H y P e r和roGFP2::Orp1)線蟲為模型檢測(cè)不同枸杞提取物對(duì)線蟲胞質(zhì)中H2O2的清除能力,將同步化后L4時(shí)期的兩種轉(zhuǎn)基因線蟲分別放置于對(duì)照或混合有枸杞提取物的NGM平板上培養(yǎng)。4 d后用M9緩沖液將線蟲轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,用M9緩沖液洗滌3 次。然后用200 μL M9緩沖液重懸后轉(zhuǎn)移到黑色96 孔酶標(biāo)板中并檢測(cè)。HyPer和Orp1探針特異性感知胞質(zhì)氧化還原狀態(tài),HyPer探針氧化態(tài)和還原態(tài)的激發(fā)光波長(zhǎng)分別為488 nm和405 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為530 nm,以480 nm與405 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度的比值表示胞質(zhì)H2O2相對(duì)含量。Orp1探針氧化態(tài)和還原態(tài)的激發(fā)光波長(zhǎng)分別為405 nm和488 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)同為530 nm,以405 nm與488 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度的比值表示胞質(zhì)H2O2的相對(duì)含量。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同產(chǎn)地枸杞體外抗氧化能力評(píng)價(jià)

        本實(shí)驗(yàn)利用FRAP法[19]體外檢測(cè)比較不同產(chǎn)地枸杞抗氧化能力的差異,同時(shí)以Trolox為對(duì)照評(píng)估枸杞樣品質(zhì)量濃度與抗氧化力之間的關(guān)系。

        表 1 不同產(chǎn)地枸杞提取物體外總抗氧化能力(n=3)Table 1 Total antioxidant capacity of Goji berries at different concentrations (n= 3)

        由表1可知,3 個(gè)產(chǎn)地的枸杞均具有很強(qiáng)的體外抗氧化能力,它們之間沒有顯著差異。隨著枸杞質(zhì)量濃度的提高,其抗氧化能力梯度增加,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇枸杞質(zhì)量濃度50 mg/mL做進(jìn)一步研究。

        2.2 枸杞對(duì)線蟲體內(nèi)ROS和抗氧化酶水平的影響

        枸杞在體外有明顯的抗氧化作用,為深入探究寧夏中寧枸杞在生物體內(nèi)的抗氧化作用,本實(shí)驗(yàn)采用ROS-敏感染料DCFH-DA檢測(cè)枸杞對(duì)線蟲體內(nèi)ROS水平的影響。由表2可知,枸杞可以降低線蟲體內(nèi)的ROS水平。同時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,枸杞可以提高抗氧化物酶基因sod-1、sod-2、gcs-1的相對(duì)表達(dá)水平。

        表 2 枸杞對(duì)線蟲體內(nèi)ROS水平和抗氧化物酶基因相對(duì)表達(dá)水平的影響(n=3)Table 2 Effect of Goji berries on the level of ROS and the relative expression of antioxidant enzymes in C. elegans (n= 3)

        2.3 枸杞對(duì)線蟲壽命的影響

        圖 1 枸杞對(duì)線蟲壽命的影響Fig. 1 Effect of Goji berries on the lifespan of C. elegans

        為了深入闡述枸杞在延緩衰老和延長(zhǎng)壽命方面的功效,以野生型N2線蟲為模型統(tǒng)計(jì)了中寧枸杞對(duì)線蟲壽命的影響。已有研究報(bào)道白藜蘆醇可以延長(zhǎng)線蟲壽命[20-21],本實(shí)驗(yàn)以白藜蘆醇為陽性對(duì)照,分析了枸杞對(duì)線蟲壽命的影響,發(fā)現(xiàn)與陽性對(duì)照相比,枸杞對(duì)線蟲的最長(zhǎng)壽命沒有顯著延長(zhǎng)作用(圖1)。

        2.4 枸杞對(duì)線蟲產(chǎn)卵能力的影響

        中醫(yī)理論中,枸杞具有“益精補(bǔ)腎”的傳統(tǒng)功效,很多研究也發(fā)現(xiàn)枸杞多糖在保護(hù)生殖系統(tǒng)方面具有重要作用[22-23]。有臨床研究顯示,每日服用枸杞子50 g,連續(xù)10 d,可使男性血中睪酮含量顯著升高,從而改善精子運(yùn)動(dòng)能力,可以用于治療弱精子癥[24],而且枸杞多糖能夠促進(jìn)大鼠睪丸支持細(xì)胞體外增殖[25]。為了探索中寧枸杞是否在改善線蟲生殖方面具有一定的功效,以野生型N2線蟲為模型統(tǒng)計(jì)了枸杞對(duì)線蟲產(chǎn)卵數(shù)量的影響。經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)枸杞對(duì)線蟲的產(chǎn)卵總數(shù)、開始產(chǎn)卵的時(shí)間、結(jié)束產(chǎn)卵的時(shí)間以及產(chǎn)卵高峰期都沒有明顯的改變(圖2、3)。

        圖 2 枸杞對(duì)線蟲產(chǎn)卵總數(shù)的影響Fig. 2 Effect of Goji berries on the total number of eggs laid by C. elegans

        圖 3 枸杞對(duì)線蟲日產(chǎn)卵數(shù)的影響Fig. 3 Effect of Goji berries on the number of daily eggs laid by C. elegans

        2.5 枸杞通過清除線粒體超氧陰離子在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用

        雖然有研究分析了枸杞多糖對(duì)體外活性氧自由基的清除作用[26],但枸杞對(duì)細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器中ROS的清除作用鮮有報(bào)道。利用帶有熒光標(biāo)記可以感知胞質(zhì)中H2O2水平的Pmyo3::HyPer[27]和roGFP2::Orp1[28]兩種轉(zhuǎn)基因線蟲為模型,檢測(cè)了枸杞提取物對(duì)胞質(zhì)中H2O2的清除能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,枸杞總提取物對(duì)細(xì)胞質(zhì)中H2O2水平都沒有顯著的影響。利用·特異的熒光探針MitoSox Red進(jìn)一步檢測(cè)了枸杞提取物對(duì)野生型線蟲體內(nèi)·水平的影響,發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組,枸杞提取物可以顯著降低·水平(表3)。因此,枸杞提取物的抗氧化能力很可能是通過清除細(xì)胞線粒體中·來實(shí)現(xiàn)的。

        表 3 枸杞對(duì)細(xì)胞中線粒體和胞質(zhì)ROS的清除能力(n=3)Table 3 ROS scavenging effect of Goji berries in mitochondria and cytoplasm (n= 3)

        3 討 論

        衰老是指隨著時(shí)間推移,生物的生理結(jié)構(gòu)完整性喪失,導(dǎo)致退行性病變和機(jī)能衰退,適應(yīng)性和抵抗力減退,死亡率增加的過程[29]。衰老伴隨著機(jī)體各個(gè)組織器官的老化和退行性病變,與腫瘤、心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等一系列嚴(yán)重威脅人類健康的疾病密切相關(guān)。由于衰老對(duì)人類健康和生命造成了巨大威脅,探索衰老的機(jī)制、尋求延緩衰老的方法既是一個(gè)古老的問題,又是一個(gè)嶄新的科研領(lǐng)域。為了驗(yàn)證并深入探索《本草綱目》中記載的“枸杞子久服可輕身不老”的功效,以線蟲為動(dòng)物模型開展了相關(guān)實(shí)驗(yàn),雖然結(jié)果顯示枸杞提取物對(duì)線蟲的最長(zhǎng)壽命和產(chǎn)卵能力沒有顯著影響,但這與其抗衰老功效并不矛盾,而且這與前人研究發(fā)現(xiàn)枸杞對(duì)果蠅和小鼠的最長(zhǎng)壽命沒有顯著影響是一致的[3],因?yàn)榭顾ダ喜⒉坏韧谘娱L(zhǎng)最長(zhǎng)壽命。隨著科技進(jìn)步,人們對(duì)于衰老機(jī)制的認(rèn)識(shí)越來越深入,目前關(guān)于誘導(dǎo)衰老的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面:基因組不穩(wěn)定性、端??s短、表觀遺傳學(xué)改變、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)喪失、營(yíng)養(yǎng)敏感度降低、線粒體功能障礙、細(xì)胞衰老、干細(xì)胞耗竭和細(xì)胞間通訊改變等[29]。這些機(jī)制從各個(gè)方面闡述了衰老誘導(dǎo)的機(jī)體變化和抵抗衰老效應(yīng)的可能方法,所以枸杞可能是通過調(diào)控細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)或線粒體功能等來發(fā)揮促進(jìn)健康衰老功效的,這還有待于進(jìn)一步深入研究。

        自由基衰老學(xué)說是經(jīng)典的衰老學(xué)說之一,其認(rèn)為自由基過度積累導(dǎo)致DNA損傷或蛋白質(zhì)等大分子氧化損傷是導(dǎo)致衰老的重要原因,所以抗氧化被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)抗衰老的重要方法。事實(shí)上,只有自由基的產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)嚴(yán)重失衡時(shí)才會(huì)導(dǎo)致組織的損傷。適量自由基的產(chǎn)生不僅為機(jī)體提供和傳遞能量,還是體內(nèi)多種代謝和信號(hào)通路的啟動(dòng)者和調(diào)節(jié)者,參與體內(nèi)炎癥免疫、代謝、細(xì)胞增殖、組織再生修復(fù)等各種生命過程的調(diào)節(jié)。而且細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器的氧化還原狀態(tài)是不同的,細(xì)胞質(zhì)和線粒體是偏還原態(tài)的,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是偏氧化態(tài)的,最近的研究也發(fā)現(xiàn)隨著衰老過程的發(fā)生,細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向還原狀態(tài)轉(zhuǎn)變,而細(xì)胞質(zhì)和線粒體則向氧化態(tài)轉(zhuǎn)變[30]。所以,深入研究枸杞在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化能力的機(jī)制需要具體研究其作用的細(xì)胞器。本實(shí)驗(yàn)利用感受不同細(xì)胞器中ROS的熒光探針,檢測(cè)了枸杞對(duì)細(xì)胞質(zhì)和線粒體中ROS的清除能力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,枸杞可以降低線粒體中O2-·的水平,主要在線粒體中發(fā)揮抗氧化作用。前期研究也發(fā)現(xiàn)枸杞在阿爾茨海默病模式線蟲中可以調(diào)控線粒體應(yīng)激反應(yīng)[31],這也提示了枸杞在線粒體中的重要功能。因此,枸杞在線粒體中的抗氧化作用可能是其抗衰老作用的一種機(jī)制。

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