曲蕙名，王 瑩，趙 博，劉建龍，劉可春，沈 紅，楚 杰,*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物研究所，山東 濟(jì)南 250103；2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014）

β-胡蘿卜素屬于萜烯類化合物，由于其多烯烴的結(jié)構(gòu)，β-胡蘿卜素有較強(qiáng)的自由基清除能力及較好的抗氧化活性，同時(shí)具有抗癌、提高免疫力和繁殖力等功效[1-3]。H2O2作為一種強(qiáng)氧化劑，可造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，引起DNA和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而H2O2濃度適宜并在保護(hù)劑的作用下，這種損傷是可逆的，有可能被修復(fù)[4-5]。

斑馬魚作為一種新型模式脊椎動(dòng)物，具有繁殖能力強(qiáng)、生殖周期短、胚胎透明、能在顯微鏡下進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察等特點(diǎn)。其基因與人類基因有著87%的相似性，被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局列為繼人和嚙齒類鼠之后的第三大模式生物，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究[6-7]。

本研究利用不同濃度的H2O2處理斑馬魚仔魚，通過(guò)對(duì)斑馬魚生化指標(biāo)的檢測(cè)、肝臟形態(tài)的觀察以及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)，確定了H2O2對(duì)斑馬魚仔魚的肝臟毒性以及β-胡蘿卜素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的斑馬魚肝損傷的保護(hù)作用，為β-胡蘿卜素的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-胡蘿卜素為本實(shí)驗(yàn)室由三孢布拉霉發(fā)酵后分離提取獲得（純度90%以上）。

體積分?jǐn)?shù)30% H2O2、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdelyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒 日本Takara公司；雙蒸水、斑馬魚培養(yǎng)水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)系統(tǒng) 北京愛(ài)生科技有限公司；UV-2100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海合利儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SZX-16體視熒光顯微鏡 日本Olympus公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀 美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 斑馬魚仔魚的準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AB系、T3系斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖參照Westerfield[8]的方法。相較于其他模式生物，斑馬魚具有諸多優(yōu)勢(shì)：其基因與人類基因有87%的相似性，它們的編碼蛋白結(jié)構(gòu)相似而且在生物體內(nèi)發(fā)揮類似的功能；胚胎透明，可實(shí)時(shí)觀察藥物毒性和活性；飼養(yǎng)方便，繁殖周期短[9-12]。斑馬魚肝臟形態(tài)在受精后48 h時(shí)初步形成，在受精后60～72 h時(shí)迅速生長(zhǎng)至合適大小[12]，因此本實(shí)驗(yàn)采用受精后72 h的斑馬魚仔魚作為肝臟氧化損傷評(píng)價(jià)模型。

選擇成熟的AB系斑馬魚，按照雌魚與雄魚數(shù)量1∶1或1∶2的比例置入繁殖缸內(nèi)，中間放置隔板，次日清晨抽去隔板，光照刺激產(chǎn)卵后收集受精卵。加入幾滴亞甲基藍(lán)溶液，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化備用[13]。

1.3.2 氧化損傷造模

1.3.2.1 分組與給藥

將體積分?jǐn)?shù)30% H2O2溶液用新鮮的斑馬魚培養(yǎng)水配制成濃度為8.8 mmol/L的母液備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)將H2O2母液用培養(yǎng)水稀釋為0.11、0.22、0.44 mmol/L的工作液。

在斑馬魚胚胎發(fā)育至受精后3 d自然脫膜后，挑選發(fā)育正常的斑馬魚仔魚移入6 孔板中，每孔30 條，每個(gè)濃度組設(shè)5 個(gè)重復(fù)孔。模型組樣孔中預(yù)先加入5 mL不同濃度（0.11、0.22、0.44 mmol/L）的H2O2溶液，空白對(duì)照組加入5 mL新鮮培養(yǎng)水。將給藥后的6 孔板放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，孵育48 h備用。上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程用不同批次的仔魚重復(fù)3 次。

1.3.2.2 抗氧化酶活力及MDA含量的測(cè)定

不同濃度的H2O2處理48 h后，收集魚體進(jìn)行勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定勻漿液中ALT、AST、SOD活力和MDA含量。

1.3.3 β-胡蘿卜素對(duì)斑馬魚肝損傷的保護(hù)作用測(cè)定

1.3.3.1 分組與給藥

配制5 mg/mL的β-胡蘿卜素母液，將5 mg/mL的β-胡蘿卜素母液稀釋為2.5、1.25 mg/mL的β-胡蘿卜素母液。分別取1.25、2.5、5 mg/mL的β-胡蘿卜素母液20 μL置于6 孔板中，用0.22 mmol/L的H2O2補(bǔ)至5 mL，得到終質(zhì)量濃度分別為5、10、20 μg/mL的β-胡蘿卜素實(shí)驗(yàn)組。

將1.3.1節(jié)中受精后3 d發(fā)育正常的斑馬魚仔魚隨機(jī)分成5 組，空白對(duì)照組、氧化造模組和β-胡蘿卜素低、中、高劑量組（5、10、20 μg/mL）?？瞻讓?duì)照組在6 孔板中加入5 mL新鮮培養(yǎng)水；氧化造模組加入5 mL的0.22 mmol/L的H2O2。每組設(shè)置5 個(gè)重復(fù)孔，每孔30 條魚。將給藥后的6 孔板放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，孵育48 h備用。上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程用不同批次的仔魚重復(fù)3 次。

1.3.3.2 抗氧化酶活力及MDA含量的測(cè)定

分組給藥處理48 h后，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定勻漿液中ALT、AST、SOD活力和MDA含量。

1.3.3.3 肝臟形態(tài)觀察

以受精后3 d的肝臟綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚仔魚T3（lfabp: EGFP）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，給藥處理48 h后，體視顯微鏡下觀察仔魚肝臟熒光和形態(tài)的變化。H2O2以及β-胡蘿卜素組給藥方法同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.4 肝組織病理學(xué)檢測(cè)

將1.3.3.1節(jié)中給藥處理48 h后的AB系斑馬魚用多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，封片后制備組織切片，顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)并拍照。

1.3.3.5 實(shí)時(shí)定量PCR

按照試劑盒說(shuō)明書提取斑馬魚總RNA，分光光度計(jì)法測(cè)定RNA溶液的吸光度；反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SOD、CAT、GSTP2、Nrf2和β-actin的引物根據(jù)GenBank中斑馬魚的基因登錄序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列如表1所示。

表 1 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)引物序列Table 1 Sequences of primers used for qPCR amplification

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以單因素方差分析和Tukey’s多因素t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2對(duì)斑馬魚仔魚的肝臟毒性

表 2 H2O2對(duì)斑馬魚仔魚AST、ALT和SOD活力以及MDA含量的影響Table 2 Effect of H2O2 on the activity of AST, ALT and SOD and the content of MDA in zebrafish larvae

如表2所示，不同濃度的H2O2處理斑馬魚仔魚48 h后，與空白對(duì)照組相比，模型組ALT、AST活力均有升高；SOD活力極顯著降低，MDA含量升高，且呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。高濃度H2O2組中斑馬魚仔魚出現(xiàn)畸形、死亡。選擇0.22 mmol/L的H2O2用于斑馬魚氧化應(yīng)激肝損傷模型的制備。

2.2 β-胡蘿卜素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的斑馬魚肝損傷的保護(hù)作用

表 3 β-胡蘿卜素對(duì)氧化損傷斑馬魚仔魚AST、ALT 和SOD活力以及MDA含量的影響Table 3 Effect of β-carotene on the activity of AST, ALT and SOD and the content of MDA in zebra fi sh larvae with H2O2-induced oxidative damage

如表3所示，與模型組相比，β-胡蘿卜素能極顯著抑制ALT活力的升高，明顯升高SOD活力，極顯著降低MDA的含量，說(shuō)明β-胡蘿卜素能有效降低H2O2對(duì)斑馬魚仔魚造成的氧化應(yīng)激損傷。

2.3 肝臟形態(tài)觀察及病理學(xué)檢測(cè)

圖 1 給藥處理48 h后斑馬魚仔魚肝臟形態(tài)學(xué)變化Fig. 1 Liver morphological change of zebrafish larvae after 48 h H2O2 induction

給藥處理48 h后，熒光顯微鏡下觀察H2O2和β-胡蘿卜素對(duì)斑馬魚肝臟大小和熒光強(qiáng)度的影響。如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，模型組斑馬魚肝臟熒光強(qiáng)度降低，肝臟明顯萎縮退化。與模型組相比，β-胡蘿卜素組肝臟熒光強(qiáng)度增大，肝損傷有一定程度的減輕。

圖 2 β-胡蘿卜素對(duì)H2O2致肝損傷斑馬魚仔魚肝臟組織病變的影響Fig. 2 Effect of β-carotene on liver histopathology of zebra fi sh larvae induced by H2O2

如圖2所示，空白對(duì)照組中出生后5 d的仔魚肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝臟細(xì)胞染色體豐富。模型組中H2O2導(dǎo)致仔魚肝臟細(xì)胞核萎縮，肝細(xì)胞腫脹、壞死，部分肝細(xì)胞胞質(zhì)透亮，胞漿疏松，肝臟嚴(yán)重空泡化。β-胡蘿卜素組中仔魚肝損傷有一定程度的減輕，高劑量組保護(hù)效果最顯著。

2.4 核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及下游抗氧化基因相對(duì)表達(dá)量

圖 3 β-胡蘿卜素對(duì)H2O2致肝損傷斑馬魚仔魚抗氧化酶基因和Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 3 Effect of β-carotene on mRNA expression of antioxidant enzymes and Nrf2 in zebra fi sh larvae induced by H2O2

如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低；與模型組相比，β-胡蘿卜素能明顯上調(diào)Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，其中β-胡蘿卜素高劑量組效果最顯著。

與空白對(duì)照組相比，模型組S O D、C A T、GSTP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，β-胡蘿卜素處理后能明顯上調(diào)抗氧化酶基因相對(duì)表達(dá)量，對(duì)SOD和CAT的相對(duì)表達(dá)量的影響最明顯。3 個(gè)劑量組中，β-胡蘿卜素高劑量組對(duì)抗氧化酶基因相對(duì)表達(dá)量的上調(diào)效果最顯著。

3 討 論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受有害刺激時(shí)，體內(nèi)的活性分子如活性氧、氮自由基產(chǎn)生并堆積，超出了機(jī)體對(duì)過(guò)氧化物的清除能力，破壞了機(jī)體氧化還原系統(tǒng)的平衡[14-15]。H2O2作為一種強(qiáng)氧化劑，能氧化酶的巰基，使酶失去活性；透過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)鐵反應(yīng)生成含氧自由基，對(duì)蛋白質(zhì)和DNA造成損害[16-17]；誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，促使肝纖維化，因此常用于細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷造模和保護(hù)劑的篩選[18-20]。本研究使用不同濃度的H2O2損傷斑馬魚仔魚，構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，通過(guò)對(duì)ALT、AST、SOD活力和MDA含量的測(cè)定，最終選擇0.22 mmol/L的H2O2為最適誘導(dǎo)濃度，為本研究提供了良好的模型基礎(chǔ)。

ALT和AST主要分布在肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞病變壞死時(shí)，ALT和AST活力會(huì)升高，是目前常用的反映肝功能的指標(biāo)[21]。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)機(jī)體免受損傷；自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，如MDA、酮基和氫過(guò)氧自由基等。SOD活力反映了機(jī)體清除自由基的能力，而MDA含量可反映細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[22-23]。

β-胡蘿卜素由于其抗氧化、防癌等功效受到廣泛關(guān)注，在體內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)化可與細(xì)胞膜中脂質(zhì)相溶，在自由基對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害前將其淬滅，阻斷其氧化過(guò)程，從而對(duì)膜脂起保護(hù)作用[24]。β-胡蘿卜素抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用可能是抗肝損傷的作用機(jī)制之一，其護(hù)肝作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究多見(jiàn)于小鼠上[25-26]，對(duì)于斑馬魚肝臟的保護(hù)作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究中發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的低、中、高劑量組均能有效降低斑馬魚ALT、AST活力和MDA含量，顯著提高SOD活力，說(shuō)明β-胡蘿卜素能夠加快自由基的清除，從而減輕含氧自由基對(duì)肝細(xì)胞的損傷。

Keap1-Nrf2-ARE通路是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的機(jī)體抵抗內(nèi)外界氧化和化學(xué)等刺激的防御性信號(hào)通路，是抗毒、抗氧化研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，Nrf2是關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子和激活該信號(hào)通路的開(kāi)關(guān)，同樣也是魚類調(diào)節(jié)下游抗氧化酶基因表達(dá)量的最主要調(diào)控因子，其高水平表達(dá)于解毒器官中，尤其是肝臟[27-28]。研究表明較高濃度和長(zhǎng)時(shí)間的氧化應(yīng)激對(duì)Nrf2的表達(dá)量有下調(diào)的作用[29-30]，本實(shí)驗(yàn)中H2O2處理受精48 h后斑馬魚仔魚表達(dá)量明顯下調(diào)，β-胡蘿卜素對(duì)Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量有上調(diào)的作用，并且一定程度上調(diào)主要抗氧化酶SOD、CAT、GSTP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，其抗氧化機(jī)理可能是通過(guò)激活Nrf2，上調(diào)細(xì)胞的抗氧化酶基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶清除自由基的能力。

本實(shí)驗(yàn)以H2O2作為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)因子，研究β-胡蘿卜素對(duì)斑馬魚仔魚肝臟的保護(hù)作用及其抗氧化作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，β-胡蘿卜素有良好的肝保護(hù)作用，為β-胡蘿卜素作為抗氧化劑和藥物的應(yīng)用提供了理論支持。