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        p-辛弗林通過激活A(yù)MPK-FoxO1信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成

        2019-04-02 03:42:48郭莉霞張永紅殷鐘意蒲語涵鄭旭煦
        食品科學(xué) 2019年5期
        關(guān)鍵詞:糖異生磷酸化肝細(xì)胞

        郭莉霞,張永紅,殷鐘意,蒲語涵,鄭旭煦,*

        (1.天然藥物研究重慶高校市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶工商大學(xué),重慶 400067;2.廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心,重慶工商大學(xué),重慶 400067;3.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,重慶 400016)

        p-辛弗林(p-synephrine)為酸橙(Citrus aurantium)、中藥枳實(shí)(Fructus Aurantii Immaturus)中的主要成分(圖1)[1-3]。據(jù)《名醫(yī)別錄》、《本草綱目》等中醫(yī)藥書籍記載,枳實(shí)有破氣消積、化痰散痞、理氣寬中、行滯消脹等功效。美國食品藥品監(jiān)督管理局禁止膳食補(bǔ)充劑中添加麻黃堿,p-辛弗林由于結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)如腎上腺素和去甲腎上腺素相似,具有促進(jìn)能量消耗、抑制食欲、提高代謝和產(chǎn)熱等作用[4],可以替代麻黃堿發(fā)揮減肥功效[5-6]。

        圖 1 p-辛弗林結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of p-synephrine

        作為減肥促進(jìn)劑,p-辛弗林現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在外周組織中有很多作用,包括促進(jìn)脂肪組織發(fā)生脂質(zhì)分解,增加生熱作用[7];增加肝細(xì)胞內(nèi)cAMP含量,促進(jìn)葡萄糖的呼吸作用[8-9];刺激肌肉組織中腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)磷酸化,誘導(dǎo)肌細(xì)胞葡萄糖的消耗等[10]。這些結(jié)果顯示,p-辛弗林具有潛在的抗高血糖的活性。本研究在此基礎(chǔ)之上,探討p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖生成的影響及其具體作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        人肝癌HepG2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

        p-辛弗林(純度≥98%)、葡萄糖分析試劑盒、AMPK抑制劑Dorsomorphin(Compound C) 美國Sigma-Aldrich公司;CellTiter 96 AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑盒 美國Promega公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國Gibco公司;磷酸化AMPK(p-AMPK)、AMPKα1/2、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl coenzyme A synthetase,ACC)、磷酸化ACC(p-ACC)、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子1(forkhead box class O1,F(xiàn)oxO1)、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)等特異性抗體 美國CST公司;AMPK siRNA 美國Santa Cruz公司;FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑 瑞士Roche公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher公司;酶標(biāo)儀瑞士TECAN公司;ChemiDoc XRS系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

        1.3 方法

        1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活力檢測

        人肝癌HepG2細(xì)胞株于高糖DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 單位/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)中,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

        取對(duì)數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞(5×103個(gè)/孔)接入到96 孔板中,細(xì)胞過夜貼壁,加入終濃度為1、10、50、100、200 μmol/L的p-辛弗林作用24 h后,每孔加入20 μL MTS試劑,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1~4 h,用酶標(biāo)儀于490 nm波長處讀取吸光度,分析細(xì)胞活力[11-12]。

        1.3.2 葡萄糖生成檢測

        取對(duì)數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞(2×105個(gè)/孔)接入24 孔板中,細(xì)胞過夜貼壁后,換用不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),同時(shí)加入終濃度為0.1、1、10、100 μmol/L的p-辛弗林或100 nmol/L胰島素(陽性對(duì)照)作用細(xì)胞6 h,然后用磷酸鹽緩沖液漂洗2 次,去掉培養(yǎng)基中的葡萄糖,接著用不含葡萄糖和酚紅的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,收集上清液,利用葡萄糖分析試劑盒測定葡萄糖的質(zhì)量濃度,葡萄糖相對(duì)生成量以占對(duì)照組(未加入p-辛弗林或胰島素)的比例表示[13]。

        當(dāng)檢測AMPK信號(hào)通路在p-辛弗林抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成中的作用時(shí),在孵育p-辛弗林前先孵育AMPK抑制劑Compound C(20 μmol/L)1 h,再加入p-辛弗林繼續(xù)孵育6 h后,然后按照上述方法檢測葡萄糖相對(duì)生成量、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase)、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)活力等指標(biāo)。

        1.3.3 Western blot蛋白印跡檢測蛋白表達(dá)

        取對(duì)數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞(2×106個(gè)/孔)接入到6 孔板中,細(xì)胞過夜貼壁后,換用不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),同時(shí)加入終濃度為0.1、1、10、100 μmol/L的p-辛弗林作用細(xì)胞6 h,磷酸鹽緩沖液漂洗2 次,冰上裂解藥物作用后的HepG2細(xì)胞,二喹啉甲酸法測定總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,上樣總蛋白質(zhì)量為50 μg,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,電轉(zhuǎn)蛋白至聚偏氟乙烯膜,用TBST配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h,然后按體積比1∶1 000加入各蛋白一抗抗體(p-AMPK、AMPKα1/2、p-ACC、ACC、p-FoxO1、FoxO1),室溫孵育2 h,TBST漂洗3 次后加入HRP標(biāo)記的二抗(體積比1∶2 000),室溫孵育2 h,TBST漂洗3 次,ECL法顯影,ChemiDoc XRS采集圖像。Quantity One軟件對(duì)蛋白印跡分析,實(shí)驗(yàn)以肌動(dòng)蛋白(Actin)為內(nèi)參,結(jié)果以磷酸化比例表示[14]。

        1.3.4 酶活力檢測

        G6Pase活力檢測:收集藥物作用后的HepG2細(xì)胞于裂解液(20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)、250 mmol/L蔗糖、10 μmol/L蛋白酶抑制劑,pH 7.0)中,冰上超聲裂解10 min。然后4 ℃、12 000×g離心20 min,收集上清液以最大轉(zhuǎn)速繼續(xù)離心60 min,沉淀物于200 μL反應(yīng)液(20 mmol/L葡萄糖-6-磷酸、50 mmol/L Tris-二甲砷酸鹽緩沖液,pH 6.5)中重懸,35 ℃孵育20 min。加200 μL終止液(0.36 mmol/L鉬酸銨、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉、1 mmol/L H2SO4、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.4%抗壞血酸)終止反應(yīng),然后45 ℃繼續(xù)孵育30 min,用酶標(biāo)儀于820 nm波長處測吸光度[15]。

        PEPCK活力檢測:收集藥物作用后的HepG2細(xì)胞于裂解液(10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、250 mmol/L蔗糖、50 μmol/L KCl,pH 7.2)中,冰上超聲裂解,然后4 ℃、10 000×g離心30 min。測定總蛋白質(zhì)量濃度。100 μg總蛋白中加入反應(yīng)緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、2 mmol/L MnCl2、2.5 U/mL蘋果酸脫氫酶和還原型的NADH),加入0.4 mmol/L脫氧鳥苷-5’-二磷酸開始反應(yīng),用酶標(biāo)儀于340 nm波長處測吸光度[16]。

        1.3.5 siRNA的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及干擾效率分析

        取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞(2×106個(gè)/孔)接入到6 孔板中,待細(xì)胞貼壁后,用不同濃度AMPKα1/2的siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染步驟根據(jù)FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

        在用siRNA轉(zhuǎn)染24 h后,收集細(xì)胞提取總蛋白,Western蛋白印跡分析干擾效率,篩選建立瞬時(shí)干擾AMPK表達(dá)的細(xì)胞,然后再比較正常HepG2細(xì)胞(空白組)、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒HepG2細(xì)胞(陰性空質(zhì)粒組)及基因敲除AMPK的HepG2細(xì)胞(AMPK siRNA組)的葡萄糖相對(duì)生成量、G6Pase、PEPCK活力等指標(biāo)。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

        2 結(jié)果與分析

        2.1 p-辛弗林對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活力的影響

        圖 2 p-辛弗林對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活力的影響(n=8)Fig. 2 Effect of p-synephrine on HepG2 cell viability (n = 8)

        由圖2可知,不同濃度的p-辛弗林作用人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后,細(xì)胞活力無顯著性改變(P>0.05),提示直到作用濃度為200 μmol/L時(shí),p-辛弗林也沒有損傷細(xì)胞的完整性;因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,采用0~100 μmol/L的p-辛弗林進(jìn)行肝細(xì)胞葡萄糖生成研究。

        2.2 p-辛弗林對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞葡萄糖生成的影響

        圖 3 p- 辛弗林對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞葡萄糖生成的影響(n=5)Fig. 3 Effect of p-synephrine on glucose production in HepG2 cells (n = 5)

        通過測定HepG2細(xì)胞葡萄糖生成的情況來反映p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖代謝的影響。如圖3所示,在0.1~100 μmol/L的p-辛弗林作用HepG2細(xì)胞6 h后,肝細(xì)胞葡萄糖生成呈濃度依賴性降低。提示p-辛弗林能抑制HepG2細(xì)胞葡萄糖生成。

        2.3 p-辛弗林對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞AMPK-FoxO1信號(hào)通路及其葡萄糖異生相關(guān)酶活力的影響

        為了研究p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖異生關(guān)鍵蛋白潛在的影響,本研究檢測了細(xì)胞能量平衡傳感器AMPK信號(hào)通路中AMPK、ACC磷酸化水平及下游轉(zhuǎn)錄因子FoxO1磷酸化變化[17]。如圖4A、B所示,與對(duì)照組相比較,p-辛弗林作用6 h后,AMPK、ACC、FoxO1的磷酸化比例都呈濃度依賴性增加。10 μmol/L的p-辛弗林作用后,AMPK、ACC、FoxO1的磷酸化比例分別為對(duì)照組的2.5、3.4 倍和2.3 倍。G6Pase和PEPCK活力也呈濃度依賴性降低(圖4C、D)。

        圖 4 p-辛弗林對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞AMPK-FoxO1信號(hào)通路及其葡萄糖異生相關(guān)酶活力的影響Fig. 4 Effect of p-synephrine on AMPK-FoxO1 signaling pathway and the activities of gluconeogenic enzymes in HepG2 cells

        2.4 AMPK信號(hào)通路在p-辛弗林抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成中的作用

        AMPK信號(hào)通路中的AMPK是肝臟糖異生的關(guān)鍵因子。本研究利用AMPK信號(hào)通路抑制劑Compound C進(jìn)一步考察AMPK信號(hào)通路在p-辛弗林抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成中的作用。

        圖 5 AMPK信號(hào)通路在p-辛弗林抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成中的作用(n=10)Fig. 5 Effect of p-synephrine on glucose production and gluconeogenic enzymes in the presence of Compound C in HepG2 cells (n = 10)

        如圖5所示,提前用20 μmol/L Compound C孵育HepG2細(xì)胞能夠極顯著抑制p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖生成、G6Pase和PEPCK活力的抑制作用(P<0.01)。

        2.5 p-辛弗林對(duì)基因敲除AMPK的HepG2肝細(xì)胞葡萄糖生成的影響

        除了信號(hào)通路抑制劑的應(yīng)用,本研究還利用了AMPK siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2肝細(xì)胞中[13,18],干擾細(xì)胞中AMPK的表達(dá),再次考察AMPK信號(hào)通路在p-辛弗林抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成中的作用。

        圖 6 p-辛弗林對(duì)基因敲除AMPK的HepG2肝細(xì)胞葡萄糖生成的影響Fig. 6 Effect of p-synphrine on glucose production and gluconeogenic enzymes in HepG2 cells with AMPKα1/α2 silencing

        如圖6A所示,與空白組和陰性空質(zhì)粒組比較,AMPK的表達(dá)在干擾質(zhì)粒為20、40 pmol/孔時(shí)均被極顯著抑制(P<0.01),當(dāng)干擾質(zhì)粒的濃度為40 pmol/孔時(shí),AMPK表達(dá)被抑制了78%。此時(shí),相對(duì)于空白組和陰性空質(zhì)粒組,基因敲除AMPK的HepG2肝細(xì)胞中p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖生成、G6Pase和PEPCK活力無顯著性影響(P>0.05)(圖6B~D)。

        3 討 論

        本研究結(jié)果表明,p-辛弗林能夠抑制肝細(xì)胞葡萄糖的生成,這種抑制作用可能是通過激活A(yù)MPK-FoxO1信號(hào)通路從而抑制葡萄糖異生相關(guān)酶活力而實(shí)現(xiàn)的。

        肝臟糖異生是肝糖代謝的重要組成部分,對(duì)維持細(xì)胞或者機(jī)體中糖的穩(wěn)態(tài)起重要作用[19-20]。研究表明,p-辛弗林能夠增加肝細(xì)胞內(nèi)cAMP含量,促進(jìn)葡萄糖的呼吸作用[8-9],但是p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞糖異生的影響及其中的作用機(jī)制還不清楚。本研究首先在人肝癌HepG2細(xì)胞上檢測了p-辛弗林對(duì)葡萄糖生成的作用,結(jié)果證實(shí)p-辛弗林能夠部分抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成,這種抑制作用經(jīng)由AMPK信號(hào)通路。

        AMPK作為一種“能量感受器”,在肝臟等組織中廣泛表達(dá),其在調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝平衡方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用[21]。AMPK能夠調(diào)節(jié)葡萄糖和脂類代謝,降低外周胰島素抵抗[22]。本研究發(fā)現(xiàn),p-辛弗林顯著增加AMPK及其直接下游底物ACC的磷酸化表達(dá)水平,這個(gè)結(jié)果提示AMPK信號(hào)通路有可能參與了p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖生成的抑制作用。通過AMPK特異性的抑制劑Compound C和AMPK siRNA證實(shí)了這個(gè)假設(shè),p-辛弗林減少肝細(xì)胞葡萄糖生成的作用被Compound C和AMPK siRNA部分抑制。

        有研究表明,激活A(yù)MPK可以抑制肝糖異生的G6Pase和PEPCK兩個(gè)關(guān)鍵酶的活力,抑制肝糖異生,減少葡萄糖生成[23-24]。本研究中,p-辛弗林抑制了HepG2細(xì)胞中G6Pase和PEPCK活力,而且Compound C和AMPK siRNA抑制了p-辛弗林降低酶活力的作用。因此,AMPK在p-辛弗林調(diào)節(jié)肝糖異生關(guān)鍵酶活力中起重要作用。

        轉(zhuǎn)錄因子FoxO1與AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)的肝糖代謝有密切關(guān)系[25-26]。在肝臟中,活化的FoxO1(磷酸化后失去轉(zhuǎn)錄活性)通過與G6Pase和PEPCK的基因啟動(dòng)子結(jié)合而激活G6Pase和PEPCK的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)一步促進(jìn)葡萄糖生成[27-30]。本研究結(jié)果顯示,p-辛弗林呈劑量依賴性磷酸化FoxO1,這些結(jié)果闡明了p-辛弗林抑制酶活力的分子作用機(jī)制。

        綜上所述,p-辛弗林可通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路,使FoxO1磷酸化而失去轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制G6Pase和PEPCK活力,改善肝細(xì)胞糖異生,減少肝細(xì)胞葡萄糖相對(duì)生成量。激活A(yù)MPK信號(hào)通路可能是p-辛弗林調(diào)節(jié)肝細(xì)胞糖異生的機(jī)制之一。

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