郭莉霞，張永紅，殷鐘意，蒲語(yǔ)涵，鄭旭煦,*

（1.天然藥物研究重慶高校市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶工商大學(xué)，重慶 400067；2.廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心，重慶工商大學(xué)，重慶 400067；3.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016）

p-辛弗林（p-synephrine）為酸橙（Citrus aurantium）、中藥枳實(shí)（Fructus Aurantii Immaturus）中的主要成分（圖1）[1-3]。據(jù)《名醫(yī)別錄》、《本草綱目》等中醫(yī)藥書(shū)籍記載，枳實(shí)有破氣消積、化痰散痞、理氣寬中、行滯消脹等功效。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局禁止膳食補(bǔ)充劑中添加麻黃堿，p-辛弗林由于結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)如腎上腺素和去甲腎上腺素相似，具有促進(jìn)能量消耗、抑制食欲、提高代謝和產(chǎn)熱等作用[4]，可以替代麻黃堿發(fā)揮減肥功效[5-6]。

圖 1 p-辛弗林結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of p-synephrine

作為減肥促進(jìn)劑，p-辛弗林現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在外周組織中有很多作用，包括促進(jìn)脂肪組織發(fā)生脂質(zhì)分解，增加生熱作用[7]；增加肝細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，促進(jìn)葡萄糖的呼吸作用[8-9]；刺激肌肉組織中腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）磷酸化，誘導(dǎo)肌細(xì)胞葡萄糖的消耗等[10]。這些結(jié)果顯示，p-辛弗林具有潛在的抗高血糖的活性。本研究在此基礎(chǔ)之上，探討p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖生成的影響及其具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

p-辛弗林（純度≥98%）、葡萄糖分析試劑盒、AMPK抑制劑Dorsomorphin（Compound C） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；CellTiter 96 AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Promega公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；磷酸化AMPK（p-AMPK）、AMPKα1/2、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl coenzyme A synthetase，ACC）、磷酸化ACC（p-ACC）、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子1（forkhead box class O1，F(xiàn)oxO1）、磷酸化FoxO1（p-FoxO1）等特異性抗體 美國(guó)CST公司；AMPK siRNA 美國(guó)Santa Cruz公司；FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑 瑞士Roche公司。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo Fisher公司；酶標(biāo)儀瑞士TECAN公司；ChemiDoc XRS系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活力檢測(cè)

人肝癌HepG2細(xì)胞株于高糖DMEM培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 單位/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2細(xì)胞（5×103個(gè)/孔）接入到96 孔板中，細(xì)胞過(guò)夜貼壁，加入終濃度為1、10、50、100、200 μmol/L的p-辛弗林作用24 h后，每孔加入20 μL MTS試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度，分析細(xì)胞活力[11-12]。

1.3.2 葡萄糖生成檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2細(xì)胞（2×105個(gè)/孔）接入24 孔板中，細(xì)胞過(guò)夜貼壁后，換用不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)加入終濃度為0.1、1、10、100 μmol/L的p-辛弗林或100 nmol/L胰島素（陽(yáng)性對(duì)照）作用細(xì)胞6 h，然后用磷酸鹽緩沖液漂洗2 次，去掉培養(yǎng)基中的葡萄糖，接著用不含葡萄糖和酚紅的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，收集上清液，利用葡萄糖分析試劑盒測(cè)定葡萄糖的質(zhì)量濃度，葡萄糖相對(duì)生成量以占對(duì)照組（未加入p-辛弗林或胰島素）的比例表示[13]。

當(dāng)檢測(cè)AMPK信號(hào)通路在p-辛弗林抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成中的作用時(shí)，在孵育p-辛弗林前先孵育AMPK抑制劑Compound C（20 μmol/L）1 h，再加入p-辛弗林繼續(xù)孵育6 h后，然后按照上述方法檢測(cè)葡萄糖相對(duì)生成量、葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）活力等指標(biāo)。

1.3.3 Western blot蛋白印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2細(xì)胞（2×106個(gè)/孔）接入到6 孔板中，細(xì)胞過(guò)夜貼壁后，換用不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)加入終濃度為0.1、1、10、100 μmol/L的p-辛弗林作用細(xì)胞6 h，磷酸鹽緩沖液漂洗2 次，冰上裂解藥物作用后的HepG2細(xì)胞，二喹啉甲酸法測(cè)定總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，上樣總蛋白質(zhì)量為50 μg，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)蛋白至聚偏氟乙烯膜，用TBST配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，然后按體積比1∶1 000加入各蛋白一抗抗體（p-AMPK、AMPKα1/2、p-ACC、ACC、p-FoxO1、FoxO1），室溫孵育2 h，TBST漂洗3 次后加入HRP標(biāo)記的二抗（體積比1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST漂洗3 次，ECL法顯影，ChemiDoc XRS采集圖像。Quantity One軟件對(duì)蛋白印跡分析，實(shí)驗(yàn)以肌動(dòng)蛋白（Actin）為內(nèi)參，結(jié)果以磷酸化比例表示[14]。

1.3.4 酶活力檢測(cè)

G6Pase活力檢測(cè)：收集藥物作用后的HepG2細(xì)胞于裂解液（20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、250 mmol/L蔗糖、10 μmol/L蛋白酶抑制劑，pH 7.0）中，冰上超聲裂解10 min。然后4 ℃、12 000×g離心20 min，收集上清液以最大轉(zhuǎn)速繼續(xù)離心60 min，沉淀物于200 μL反應(yīng)液（20 mmol/L葡萄糖-6-磷酸、50 mmol/L Tris-二甲砷酸鹽緩沖液，pH 6.5）中重懸，35 ℃孵育20 min。加200 μL終止液（0.36 mmol/L鉬酸銨、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉、1 mmol/L H2SO4、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.4%抗壞血酸）終止反應(yīng)，然后45 ℃繼續(xù)孵育30 min，用酶標(biāo)儀于820 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度[15]。

PEPCK活力檢測(cè)：收集藥物作用后的HepG2細(xì)胞于裂解液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、250 mmol/L蔗糖、50 μmol/L KCl，pH 7.2）中，冰上超聲裂解，然后4 ℃、10 000×g離心30 min。測(cè)定總蛋白質(zhì)量濃度。100 μg總蛋白中加入反應(yīng)緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、2 mmol/L MnCl2、2.5 U/mL蘋(píng)果酸脫氫酶和還原型的NADH），加入0.4 mmol/L脫氧鳥(niǎo)苷-5’-二磷酸開(kāi)始反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于340 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度[16]。

1.3.5 siRNA的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及干擾效率分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞（2×106個(gè)/孔）接入到6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度AMPKα1/2的siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟根據(jù)FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

在用siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞提取總蛋白，Western蛋白印跡分析干擾效率，篩選建立瞬時(shí)干擾AMPK表達(dá)的細(xì)胞，然后再比較正常HepG2細(xì)胞（空白組）、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒HepG2細(xì)胞（陰性空質(zhì)粒組）及基因敲除AMPK的HepG2細(xì)胞（AMPK siRNA組）的葡萄糖相對(duì)生成量、G6Pase、PEPCK活力等指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 p-辛弗林對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活力的影響

圖 2 p-辛弗林對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活力的影響（n＝8）Fig. 2 Effect of p-synephrine on HepG2 cell viability (n = 8)

由圖2可知，不同濃度的p-辛弗林作用人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力無(wú)顯著性改變（P＞0.05），提示直到作用濃度為200 μmol/L時(shí)，p-辛弗林也沒(méi)有損傷細(xì)胞的完整性；因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，采用0～100 μmol/L的p-辛弗林進(jìn)行肝細(xì)胞葡萄糖生成研究。

2.2 p-辛弗林對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞葡萄糖生成的影響

圖 3 p- 辛弗林對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞葡萄糖生成的影響（n＝5）Fig. 3 Effect of p-synephrine on glucose production in HepG2 cells (n = 5)

通過(guò)測(cè)定HepG2細(xì)胞葡萄糖生成的情況來(lái)反映p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖代謝的影響。如圖3所示，在0.1～100 μmol/L的p-辛弗林作用HepG2細(xì)胞6 h后，肝細(xì)胞葡萄糖生成呈濃度依賴性降低。提示p-辛弗林能抑制HepG2細(xì)胞葡萄糖生成。

2.3 p-辛弗林對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞AMPK-FoxO1信號(hào)通路及其葡萄糖異生相關(guān)酶活力的影響

為了研究p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖異生關(guān)鍵蛋白潛在的影響，本研究檢測(cè)了細(xì)胞能量平衡傳感器AMPK信號(hào)通路中AMPK、ACC磷酸化水平及下游轉(zhuǎn)錄因子FoxO1磷酸化變化[17]。如圖4A、B所示，與對(duì)照組相比較，p-辛弗林作用6 h后，AMPK、ACC、FoxO1的磷酸化比例都呈濃度依賴性增加。10 μmol/L的p-辛弗林作用后，AMPK、ACC、FoxO1的磷酸化比例分別為對(duì)照組的2.5、3.4 倍和2.3 倍。G6Pase和PEPCK活力也呈濃度依賴性降低（圖4C、D）。

圖 4 p-辛弗林對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞AMPK-FoxO1信號(hào)通路及其葡萄糖異生相關(guān)酶活力的影響Fig. 4 Effect of p-synephrine on AMPK-FoxO1 signaling pathway and the activities of gluconeogenic enzymes in HepG2 cells

2.4 AMPK信號(hào)通路在p-辛弗林抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成中的作用

AMPK信號(hào)通路中的AMPK是肝臟糖異生的關(guān)鍵因子。本研究利用AMPK信號(hào)通路抑制劑Compound C進(jìn)一步考察AMPK信號(hào)通路在p-辛弗林抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成中的作用。

圖 5 AMPK信號(hào)通路在p-辛弗林抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成中的作用（n＝10）Fig. 5 Effect of p-synephrine on glucose production and gluconeogenic enzymes in the presence of Compound C in HepG2 cells (n = 10)

如圖5所示，提前用20 μmol/L Compound C孵育HepG2細(xì)胞能夠極顯著抑制p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖生成、G6Pase和PEPCK活力的抑制作用（P＜0.01）。

2.5 p-辛弗林對(duì)基因敲除AMPK的HepG2肝細(xì)胞葡萄糖生成的影響

除了信號(hào)通路抑制劑的應(yīng)用，本研究還利用了AMPK siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2肝細(xì)胞中[13,18]，干擾細(xì)胞中AMPK的表達(dá)，再次考察AMPK信號(hào)通路在p-辛弗林抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成中的作用。

圖 6 p-辛弗林對(duì)基因敲除AMPK的HepG2肝細(xì)胞葡萄糖生成的影響Fig. 6 Effect of p-synphrine on glucose production and gluconeogenic enzymes in HepG2 cells with AMPKα1/α2 silencing

如圖6A所示，與空白組和陰性空質(zhì)粒組比較，AMPK的表達(dá)在干擾質(zhì)粒為20、40 pmol/孔時(shí)均被極顯著抑制（P＜0.01），當(dāng)干擾質(zhì)粒的濃度為40 pmol/孔時(shí)，AMPK表達(dá)被抑制了78%。此時(shí)，相對(duì)于空白組和陰性空質(zhì)粒組，基因敲除AMPK的HepG2肝細(xì)胞中p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖生成、G6Pase和PEPCK活力無(wú)顯著性影響（P＞0.05）（圖6B～D）。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，p-辛弗林能夠抑制肝細(xì)胞葡萄糖的生成，這種抑制作用可能是通過(guò)激活A(yù)MPK-FoxO1信號(hào)通路從而抑制葡萄糖異生相關(guān)酶活力而實(shí)現(xiàn)的。

肝臟糖異生是肝糖代謝的重要組成部分，對(duì)維持細(xì)胞或者機(jī)體中糖的穩(wěn)態(tài)起重要作用[19-20]。研究表明，p-辛弗林能夠增加肝細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，促進(jìn)葡萄糖的呼吸作用[8-9]，但是p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞糖異生的影響及其中的作用機(jī)制還不清楚。本研究首先在人肝癌HepG2細(xì)胞上檢測(cè)了p-辛弗林對(duì)葡萄糖生成的作用，結(jié)果證實(shí)p-辛弗林能夠部分抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成，這種抑制作用經(jīng)由AMPK信號(hào)通路。

AMPK作為一種“能量感受器”，在肝臟等組織中廣泛表達(dá)，其在調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝平衡方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用[21]。AMPK能夠調(diào)節(jié)葡萄糖和脂類(lèi)代謝，降低外周胰島素抵抗[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，p-辛弗林顯著增加AMPK及其直接下游底物ACC的磷酸化表達(dá)水平，這個(gè)結(jié)果提示AMPK信號(hào)通路有可能參與了p-辛弗林對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖生成的抑制作用。通過(guò)AMPK特異性的抑制劑Compound C和AMPK siRNA證實(shí)了這個(gè)假設(shè)，p-辛弗林減少肝細(xì)胞葡萄糖生成的作用被Compound C和AMPK siRNA部分抑制。

有研究表明，激活A(yù)MPK可以抑制肝糖異生的G6Pase和PEPCK兩個(gè)關(guān)鍵酶的活力，抑制肝糖異生，減少葡萄糖生成[23-24]。本研究中，p-辛弗林抑制了HepG2細(xì)胞中G6Pase和PEPCK活力，而且Compound C和AMPK siRNA抑制了p-辛弗林降低酶活力的作用。因此，AMPK在p-辛弗林調(diào)節(jié)肝糖異生關(guān)鍵酶活力中起重要作用。

轉(zhuǎn)錄因子FoxO1與AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)的肝糖代謝有密切關(guān)系[25-26]。在肝臟中，活化的FoxO1（磷酸化后失去轉(zhuǎn)錄活性）通過(guò)與G6Pase和PEPCK的基因啟動(dòng)子結(jié)合而激活G6Pase和PEPCK的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步促進(jìn)葡萄糖生成[27-30]。本研究結(jié)果顯示，p-辛弗林呈劑量依賴性磷酸化FoxO1，這些結(jié)果闡明了p-辛弗林抑制酶活力的分子作用機(jī)制。

綜上所述，p-辛弗林可通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路，使FoxO1磷酸化而失去轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制G6Pase和PEPCK活力，改善肝細(xì)胞糖異生，減少肝細(xì)胞葡萄糖相對(duì)生成量。激活A(yù)MPK信號(hào)通路可能是p-辛弗林調(diào)節(jié)肝細(xì)胞糖異生的機(jī)制之一。