張 燕，胡 榕，鄭 健，馬中蘇，楊太芬，劉靜波*

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130062）

生物體中不同的代謝途徑會產(chǎn)生自由基，包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基，如·、HO2、H2O2和·OH，以及活性氮（reactive nitrogen species，RNS）自由基[1]。除了生理性的氧化產(chǎn)物，食品中油脂的氧化、臭氧的暴露、吸煙和紫外線照射均可能造成ROS和RNS的產(chǎn)生[2-3]。一般來講，當機體產(chǎn)生過量自由基或細胞防御失敗時，機體生物大分子如DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)等會被破壞，也被稱為氧化應激[4-5]。氧化應激會對細胞膜、組織和酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧化損傷，并促進癌癥、糖尿病和動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生與發(fā)展[6-8]。

大量實驗證明，膳食抗氧化成分的補充可以增強人體的抗氧化防御能力，降低體內(nèi)的氧化應激水平，幫助機體維持氧化和抗氧化平衡[9-14]。蛋白質(zhì)是食品和食品成分的重要組成部分。在食物蛋白質(zhì)序列中有一些片段可以表現(xiàn)出生物活性，這些片段被稱為“生物活性肽”[15-16]。生物活性肽具有比氨基酸和蛋白質(zhì)更強的生物活性和多樣性，更易吸收并且安全。大量研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的動植物源活性肽酶解物如乳清蛋白、大豆蛋白、雞蛋蛋黃蛋白、鴕鳥蛋清蛋白、花生蛋白和蛋清源活性肽等具有很強的抗氧化能力，可以清除多余的自由基[7,17-20]。生物活性肽以多種方式發(fā)揮其抑制氧化應激的特性，包括清除自由基，抑制ROS的產(chǎn)生，上調(diào)抗氧化酶活力，抑制促炎細胞因子的釋放以及降血壓等[21-24]。蛋清中含有多種功能蛋白組分，蛋清蛋白的酶解產(chǎn)物具有多種生理活性[19,25-26]，其在人類健康及疾病的預防和治療方面有巨大潛力。在前期研究中發(fā)現(xiàn)蛋清源活性肽WNWAD具有很好的抗氧化活性[27]。因此，本實驗以蛋清源活性肽WNWAD及其結構改造肽為研究對象，考察了其對H2O2誘導損傷的HEK293細胞的存活率、ROS水平、抗氧化酶活力及細胞因子白介素8（interleukin-8，IL-8）分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋清源活性肽WNWAD（Trp-Asn-Trp-Ala-Asp）、WNW（Trp-Asn-Trp）、WAD（Trp-Ala-Asp）、WN（Trp-Asn）（純度＞95%） 上海強耀生物科技有限公司；2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針（分析純） 美國Sigma公司；人胚腎HEK293細胞中國科學院細胞庫；DMEM培養(yǎng)基 美國GIBCO公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜、乙二胺四乙酸 北京鼎國生物有限公司；H2O2（分析純） 天津化學有限公司；MTS單溶液細胞增殖檢測試劑盒 美國Promega公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；IL-8酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 武漢伊艾博科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司；多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；黑色孔板（透明平底） 德國Greiner Bio-One公司；移液器 德國Eppendorf公司；超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；CO2培養(yǎng)箱 上海力申科學儀器有限公司；低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡 日本尼康公司；激光共聚焦顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清源活性肽對HEK293細胞的毒性作用

HEK293細胞培養(yǎng)方法參考Liu Jingbo等[27]的方法。完全培養(yǎng)液由DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗和非必需氨基酸溶液以體積比90∶10∶1∶1配制而成。將密度為5.0×104個/mL的HEK293細胞接種于96 孔板中，每孔接種90 μL，實驗設置空白組（100 μL培養(yǎng)基）、對照組（90 μL細胞混懸液+10 μL培養(yǎng)基）和實驗組（90 μL細胞混懸液），培養(yǎng)24 h。然后在實驗組中加入10 μL終濃度為0.1、0.5、1.0、2.0 μmol/L的蛋清源活性肽溶液（每個濃度設置6 個復孔），在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，細胞存活率的檢測采用單溶液細胞增殖檢測試劑盒，即MTS法[27]測定。

1.3.2 蛋清源活性肽對 H2O2誘導的HEK293 細胞的保護作用

將密度為6.0×104個/mL的HEK293細胞接種于96 孔板中，每孔接種80 μL。設置空白組（100 μL培養(yǎng)基）、對照組（80 μL細胞混懸液+20 μL培養(yǎng)基）、損傷組（80 μL細胞混懸液）和實驗組（80 μL細胞混懸液），每個實驗濃度設置6 個復孔。損傷模型采用本實驗室前期建立的H2O2誘導的HEK293細胞氧化損傷模型。在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，實驗組加入10 μL終濃度0.1、0.5、1.0、2.0 μmol/L的蛋清肽溶液，同時損傷組加入10 μL培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。然后，損傷組和實驗組同時加入10 μL終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液，繼續(xù)孵育12 h后，MTS法測定細胞存活率。

1.3.3 蛋清源活性肽對H2O2誘導的HEK293細胞內(nèi)ROS水平的影響

細胞內(nèi)ROS含量的測定參照文獻中已報道的DCFH-DA熒光探針法[24]。HEK293細胞以5×104個/孔的密度接種于24 孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，實驗組加入100 μL終濃度0.1、1.0 μmol/L的蛋清源活性肽溶液（每個濃度設置3 個復孔）。同時損傷組加入100 μL培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。然后，損傷組和實驗組同時加入100 μL終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液，繼續(xù)孵育2 h。然后，用移液器吸棄各孔中的培養(yǎng)液，并加入100 μL DCFH-DA溶液（溶于二甲基亞砜，終濃度為10 μmol/L），放入培養(yǎng)箱中37 ℃孵育15 min。磷酸鹽緩沖液清洗3 次后加入不完全培養(yǎng)基，在激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為525 nm下，用多功能酶標儀檢測各孔細胞的熒光強度，同時用激光共聚焦掃描顯微鏡拍照。

1.3.4 蛋清源活性肽對H2O2誘導的HEK293細胞CAT、T-SOD和GSH-Px活力的影響

將濃度為1.0×106個/mL的HEK293細胞接種于6 孔板中，每孔接種2 mL（每個濃度設置3 個復孔）。其中實驗組加入250 μL終濃度為0.1、0.5、1.0 μmol/L的蛋清源活性肽WNWAD、WNW、WAD、WN溶液，最后損傷組和實驗組同時加入250 μL終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液。培養(yǎng)結束后，棄去培養(yǎng)液，以磷酸鹽緩沖液清洗兩遍后，放置冰上，每孔加入500 μL細胞裂解液，于冰上裂解30 min，用刮板刮下細胞，然后在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，吸取各組細胞懸液，4 ℃冷藏備用（6 h內(nèi)測定完各項酶系指標）。最后按照試劑盒說明書對T-SOD、GSH-Px和CAT活力等指標進行檢測。蛋白質(zhì)含量采用BCA蛋白試劑盒定量。

1.3.5 蛋清源活性肽對H2O2誘導的IL-8活性的酶聯(lián)免疫吸附測定分析

將HEK293細胞接種于6 孔培養(yǎng)板各孔中，細胞密度為5.0×105個/mL，每孔接種量為1.5 mL（每個濃度設置3 個復孔），5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后實驗組加入250 μL終濃度為1.0 μmol/L的蛋清源活性肽溶液，空白組和損傷組加250 μL培養(yǎng)基。5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后損傷組和實驗組同時加入250 μL終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液，空白組加250 μL培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育12 h后按照按照IL-8酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒操作說明書進行測定（各試劑使用前平衡至室溫）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 蛋清源活性肽對HEK293細胞的毒性

為了排除實驗中的非特異性干擾，在不添加H2O2的情況下，通過MTS法檢測了蛋清源活性肽對HEK293細胞生長的影響。結果顯示，實驗組和對照組細胞存活率無顯著性差異，蛋清源活性肽對HEK293細胞既無促進生長作用，也無毒性或抑制生長作用，蛋清源活性肽本身對實驗結果無干擾作用（圖1）。

圖 1 蛋清源活性肽對正常HEK293細胞存活率的影響Fig. 1 Effect of peptides derived from egg white on survival rate of HEK293 cells

2.2 蛋清源活性肽對H2O2誘導的HEK293細胞氧化損傷的影響

H2O2是一種ROS，可引發(fā)脂質(zhì)過氧化從而增強氧化應激，最終可導致細胞損傷甚至死亡[28]。而加入一定的抗氧化劑可以減緩H2O2對細胞的損傷程度。本實驗中，WNWAD、WNW、WAD和WN均有氧化應激抑制作用（圖2）。只加H2O2處理的損傷組細胞存活率約為對照組的（49.8±2.0）%，與對照組有極顯著性差異（P＜0.01）；蛋清源活性肽WNWAD、WNW、WAD、WN對細胞存活率的影響均呈現(xiàn)出濃度依賴性，細胞存活率從損傷組的（48.0±2.4）%分別提高到（99.7±1.8）%、（69.4±3.2）%、（78.9±5.1）%、（7 2.1±3.6）%，與損傷組有極顯著性差異（P＜0.01），即隨著蛋清源活性肽濃度的增大，其抑制氧化應激的活性隨之增強，對氧化損傷細胞的保護作用也越強，尤其在五肽WNWAD濃度為1.0 μmol/L和2.0 μmol/L時，實驗組的細胞在其保護作用下，存活率（（99.9±2.5）%、（99.7±1.8）%）幾乎完全恢復到對照組的水平。結合2.1節(jié)細胞毒性實驗結果可以證明，蛋清源活性肽對H2O2誘導損傷的HEK293模型細胞的保護作用是通過抑制氧化應激實現(xiàn)的，而非刺激HEK293細胞增殖。

圖 2 蛋清源活性肽對H2O2氧化損傷的HEK293細胞的保護作用Fig. 2 Protective effect of peptides derived from egg white on H2O2-induced oxidative damage in HEK293 cells

2.3 蛋清源活性肽對H2O2誘導的HEK293細胞內(nèi)ROS水平的影響

采用DCFH-DA熒光探針法檢測細胞內(nèi)ROS水平變化。DCFH-DA是一種可以自由透過細胞膜的熒光染料，其本身無熒光。當DCFH-DA進入細胞后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解成為2’,7’-二氯二氫熒光素（2’,7’-dichlorodihy drofluorescein，DCFH），而DCFH不能通透細胞膜，因此DCFH-DA熒光探針可容易地裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的ROS可以將無熒光的DCFH氧化成有熒光的2’,7’-二氯熒光素（2’,7’-dichlorofluorescein，DCF）。通過檢測DCF的熒光強度便可得知細胞內(nèi)ROS的水平[28]。在熒光照片中，熒光強度越強，代表細胞內(nèi)ROS水平越高，反之則說明越低（圖3）。

圖 3 HEK293細胞中DCF熒光照片F(xiàn)ig. 3 Fluorescence images of 2’7’-dichlorofluorescein entering into HEK293 cells

圖 4 各組DCFH-DA相對熒光強度Fig. 4 Relative fl uorescence intensity of DCFH-DA in all groups

本實驗中HEK293細胞經(jīng)H2O2處理后DCF熒光強度顯著升高（P＜0.01），說明H2O2誘導了HEK293細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。而經(jīng)過蛋清源活性肽處理的實驗組，與損傷組相比，細胞內(nèi)ROS的水平極顯著降低（P＜0.01），呈濃度依賴型關系（圖4）。0.1 μmol/L和1.0 μmol/L的WNWAD、WNW、WN和WAD均顯著降低了DCF熒光強度（圖3）。然而，關于DCF熒光探針是否可以檢測特定種類的ROS仍未闡明，有報道稱DCF對H2O2有特異性，也有報道稱DCF可以檢測一系列的活性中間體[29-30]。目前無法確定本實驗中蛋清源活性肽究竟以哪種活性氧類物質(zhì)為靶點，需要接下來進一步的研究。

2.4 蛋清源活性肽對H2O2誘導的HEK293細胞中SOD、CAT和GSH-Px活力的影響

T-SOD、CAT和GSH-Px均為細胞抗氧化防御系統(tǒng)中酶類物質(zhì)的重要組成部分，對機體內(nèi)氧化和抗氧化動態(tài)平衡起著非常重要的影響。CAT可將H2O2分解為水和氧氣；還原型谷胱甘肽-SOD可清除O2-·，防止細胞受損；GSH-Px可促進H2O2和還原型谷胱甘肽反應生成水和氧化型谷胱甘肽。已有研究表明，H2O2不僅可攻擊生物膜并引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，破壞生物膜完整性，而且可以降低細胞內(nèi)抗氧化酶系活性[1]。本實驗中，HEK293細胞經(jīng)過H2O2處理后，T-SOD、CAT和GSH-Px的活力和對照組相比，均極顯著性下降（P＜0.01），在經(jīng)過WNWAD、WNW、WAD、WN處理的實驗組，隨著肽濃度的升高，3 種酶的活力均有所提高，呈現(xiàn)濃度依賴型關系（表1）。

表 1 蛋清源活性肽對H2O2誘導的HEK293細胞T-SOD、CAT和GSH-Px活力的影響Table 1 Effect of peptides derived from egg white on T-SOD, CAT and GSH-Px activity in H2O2-induced HEK293 cells

在活性肽的濃度為1.0 μmol/L時，WNWAD的T-SOD、CAT和GSH-Px的活力分別為（176.25±1.98）、（21.03±1.52）U/mg和（37.36±4.17）nmol/（min·mL）；W N W的T-S O D、C A T和G S H-P x的活力分別為（162.25±3.14）、（17.22±1.93）U/mg和（33.14±2.76）nmol/（min·mL）；WN的T-SOD、CAT和GSH-Px的活力分別為（141.39±2.22）、（16.85±0.97）U/mg和（32.19±2.62）nmol/（min·mL）；W A D的T-S O D、C A T和G S H-P x的活力分別為（157.32±1.98）、（19.74±3.78）U/mg和（35.69±1.24）nmol/（min·mL），較對應損傷組的酶活力均有極顯著提高（P＜0.01）。研究證明，GSH-Px能和SOD、CAT一起通過清除O2-·、H2O2防止·OH、1O2的產(chǎn)生，以減輕和阻斷脂質(zhì)過氧化作用同時GSH-Px還能還原脂質(zhì)過氧化物，防止其均裂和引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用的鏈式支鏈反應以減少過氧化脂（lipid peroxide，LPO）的生成[31]。

2.5 蛋清源活性肽對H2O2誘導的HEK293細胞內(nèi)IL-8的影響

IL-8是Yoshimura等[32]發(fā)現(xiàn)的第一個具有趨化功能的細胞因子。由于IL-8對于白細胞有趨化作用，所以在很多感染性疾病過程中其含量會升高，IL-8水平與心血管疾病、肝臟疾病、呼吸道疾病等疾病有關；細胞因子和氧化應激密切相關，在炎癥感染的初期階段，上皮細胞產(chǎn)生趨化因子，抗菌肽和氧自由基來調(diào)節(jié)細胞功能[33-36]。通過測定人外周血、尿液或細胞培養(yǎng)上清液中IL-8水平，可作為評判炎性疾病的臨床指標。

圖 5 蛋清源活性肽對HEK293細胞內(nèi)IL-8分泌的影響Fig. 5 Effect of peptides derived from egg white on IL-8 secretion in HEK293 cells

本實驗中HEK293細胞經(jīng)H2O2處理后，IL-8質(zhì)量濃度較對照組細胞升高，差異具有顯著性（P＜0.05），加入1.0 μmol/L的蛋清源活性肽WNWAD、WNW、WN、WAD后，細胞中IL-8質(zhì)量濃度不同程度地降低（圖5）。蛋清源活性肽對于IL-8的分泌有一定的抑制作用。

3 結 論

本實驗研究了蛋清源活性肽WNWAD、WNW、WAD、WN對H2O2誘導損傷的HEK293細胞的存活率、ROS水平、抗氧化酶活力和IL-8細胞因子分泌的影響。結果表明，蛋清源活性肽WNWAD、WNW、WAD、WN對H2O2誘導損傷的HEK293細胞具有保護作用，并且細胞存活率與活性肽濃度呈依賴型關系；活性肽降低了HEK293細胞內(nèi)由H2O2引起的ROS水平；并且提高了T-SOD、CAT和GSH-Px的活力，對HEK293細胞中細胞因子IL-8的分泌有一定的抑制作用。以上結果顯示蛋清源活性肽對降低HEK293細胞氧化應激水平、提高細胞抗氧化能力有一定影響。后續(xù)將對蛋清源活性肽的構效關系及具體的抑制氧化應激機理作進一步深入研究。