王燕 何朝暉 鄧鎮(zhèn)濤 彭莉萍 譚靜 楊愈豐

1遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)（廣東珠海519041）；2遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科腔鏡中心（廣東珠海519041）

當(dāng)今世界，癌癥是人類最主要的死因，也是影響人類壽命的最主要因素。根據(jù)權(quán)威機構(gòu)預(yù)計，2018年全球新增癌癥患者約1.81億人，死亡人數(shù)約960 萬人。其中，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）不管是新增患病人數(shù)還是死亡人數(shù)比例均排第四位［1］。CRC 作為一種常見的消化道癌癥，在中國人群中發(fā)病率和死亡率也均較高，在中國人群惡性腫瘤中排第五位［2］。90%的早期CRC 患者可以通過手術(shù)治愈，但是早期診斷主要依靠腸鏡檢查，不容易被人接受。晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CRC 患者由于缺少監(jiān)測指標(biāo)，不管是手術(shù)治療還是化療效果均不理想。

長鏈非編碼RNAs（long non?coding RNA，Ln?cRNAs）通常是指一類長度大于200 核苷酸的長鏈RNA 分子，通常不翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。近幾年已有大量研究表明LncRNAs 能通過直接與細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA 或蛋白相互作用，從而影響DNA 的轉(zhuǎn)錄或RNA 的翻譯，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡。因此，LncRNAs 也與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著千絲萬縷的關(guān)系。近年來不斷有研究報道在結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機制中LncRNAs 起著至關(guān)重要的作用［2］。LncRNAs 可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著原癌基因或抑癌基因的作用［3］，主要參與腫瘤細(xì)胞凋亡、浸潤與轉(zhuǎn)移等過程；還可以通過表觀遺傳調(diào)控的方式影響腫瘤細(xì)胞的生長。越來越多的證據(jù)顯示，LncRNAs 有希望成為新型腫瘤標(biāo)志物和腫瘤治療靶點，在腫瘤診斷和治療方面顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。

筆者在之前的研究工作中利用抑制消減雜交技術(shù)分離到一個在乳腺癌中高表達(dá)的EST 序列，經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)其與CLDND1 的序列相似度為100%。CLDND1 自2002年被NicoleAdeline Fayein發(fā)現(xiàn)后，從其預(yù)測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)果把它歸類于claudin 膜蛋白多基因家族，命名為含有claudin 結(jié)構(gòu)域的蛋白1（claudin domain containing 1）簡稱CLDND1［5］，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要在神經(jīng)組織內(nèi)高表達(dá)。但是我們的前期實驗結(jié)果顯示CLDND1 在乳腺癌組織中存在大量轉(zhuǎn)錄物，但沒有蛋白質(zhì)水平產(chǎn)物，其功能類似LncRNA，且在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用［6-7］。另有報道發(fā)現(xiàn)CLDND1 RNA 在肺癌組織中同樣高表達(dá)［8］；而在腎細(xì)胞癌中，CLDND1 RNA 轉(zhuǎn)錄水平異常上調(diào)促進了腎腫瘤細(xì)胞增殖，并提升其侵襲能力［9］。這些研究結(jié)果顯示CLDND1 RNA 與多種惡性腫瘤發(fā)生具有高度相關(guān)性。本文通過檢測CLDND1 RNA 在CRC 組織及細(xì)胞中的表達(dá)差異，并研究該RNA 轉(zhuǎn)錄水平變化SW480 細(xì)胞生長的影響，探討CLDND1 RNA 與CRC 發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，為CRC 生物標(biāo)志物尋和治療靶點的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者標(biāo)本、細(xì)胞系35 對結(jié)直癌及癌旁組織標(biāo)本均由遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院病理科提供。SW480 細(xì)胞系購買于中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞傳代接種于RPMI 1640 培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清和青霉素100 U/mL，鏈霉素0.1 mg/mL）于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.1.2 胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，qRT?PCR 試劑盒購于美國ABI 公司，F(xiàn)ISH 試劑盒購于美國Roche 公司，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 購于美國Invitrogen 公司。所用反義RNA 由上海吉瑪公司合成。其它常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 應(yīng)用qRT?PCR 技術(shù)檢測結(jié)直腸癌及癌旁組織標(biāo)本中CLDND1 差異表達(dá)收集50 對經(jīng)病理檢驗后的新鮮組織標(biāo)本，抽提組織總RNA 后經(jīng)OD260/280 分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性和純度后，根據(jù)ABI 試劑盒操作說明進行逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR 實驗。實驗重復(fù)三次，每次設(shè)三個復(fù)孔。（CLDND1 引物序列：L1?5′ATGGATA?ACCGTTTTGCTACA?3′，R1?5′TCATGCCACACGAT?ATGC?3′，R2?5′TGGTGGGCTATACCAATG?3′）。

1.2.2 構(gòu)建CLDND1 真核表達(dá)載體pEGFP?C1?CLDND1 轉(zhuǎn)染SW480 細(xì)胞，過表達(dá)CLDND1 選擇具有綠色熒光的真核表達(dá)載體pEGFP?C1，構(gòu)建CLDND1 的真核表達(dá)載體依照lipo2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明步驟轉(zhuǎn)染SW480 細(xì)胞，24 h 后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。以不含CLDND1 的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照組。

1.2.3 SW480 細(xì)胞中CLDND1 RNAi 實驗 為了進一步研究CLDND1 基因的功能，我們根據(jù)預(yù)測的CLDND1 RNA 二級結(jié)構(gòu)設(shè)計并在上海吉瑪公司合成了兩條反義RNAOligoB1/B2 分別轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，取人類不存在的序列RNA 為陰性對照，依照lipo2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明步驟分組轉(zhuǎn)染SW480 細(xì)胞，48 小時后收集細(xì)胞抽提總RNA，經(jīng)RT?PCR 技術(shù)檢測干擾效果。

1.2.4 MTT 法分析細(xì)胞增殖能力 接種細(xì)胞：用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)基配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1000 個細(xì)胞接種到96 孔板，每孔體積200 μL；培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3～5 d（可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間）；呈色：每孔加MTT 溶液（5 mg/mL 用PBS＜pH7.4 ＞配）20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解；比色：選擇490nm 波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5 AnnexinV?FITC/PI 法分析細(xì)胞凋亡 根據(jù)美國BD 公司AnnexinV?FITC/PI 試劑盒說明說，取上述轉(zhuǎn)染pEGFP?C1?CLDND1 過表達(dá)和RNAi 下調(diào)表達(dá)CLDND1 后48 h 的SW480 細(xì)胞進行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 軟件進行，計量資料差異比較采用配對樣本t檢驗，多組資料比較采用方差分析，多重比較采用Dunnett檢驗，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中CLDND1 比癌旁組織表達(dá)高 應(yīng)用qRT?PCR 方法對比檢測收集的35 對結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織中CLDND1 表達(dá)情況，所有樣本的檢測均平行重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)都以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，PCR 擴增后，采集對應(yīng)的Ct 值，得到結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的Mean Ct 值及△Ct 值。CLDND1 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.809，P＜0.001）。qRT?PCR 結(jié)果見圖1。

圖1 qRT?PCR 檢測20 對結(jié)直腸癌組織及癌旁組織CLDND1 差異表達(dá)Fig.1 Differentially expressed CLDND1 in colorectal cancer tissues and adjacent tissues was detected by qRT?PCR technology

2.2 MTT 實驗顯示高表達(dá)CLDND1 后SW480 細(xì)胞增殖能力增強 SW480 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染入pEGFP?C1（Control）和pEGFP?C1?CLDND1 后經(jīng)熒光顯微鏡觀察可見到60%～80%的細(xì)胞表達(dá)EGF 熒光蛋白，提示轉(zhuǎn)染成功，過表達(dá)CLDND1 后分別取轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染12、24、36、48、72 和96 h 七個時間點加入MTT，測定吸光度，繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果如圖2所示，過表達(dá)CLDND1 細(xì)胞組活力大于對照組。

圖2 MTT 繪制細(xì)胞生長曲線Fig.2 Cell Viability was measured by MTT assay

2.3 RNAi 技術(shù)下調(diào)SW480 細(xì)胞中CLDND1 的表達(dá) 圖中條帶由左至右為M：DNA marker；1：單加轉(zhuǎn)染試劑組；2：轉(zhuǎn)染陰性對照RNA 組；3：轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸OligoB1 組；4：轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸Oli?goB2 組，內(nèi)參為β?actin。以△△Ct 表示SW480 細(xì)胞中CLDND1 基因表達(dá)量，以2?△△Ct表示不同組之間CLDND1 基因差異表達(dá)量，組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3458.539，P＜0.001），以NC組為基準(zhǔn)多重比較結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染OligoB1 和B2 后，SW480 細(xì)胞中CLDND1 基因表達(dá)量明顯降低（P均＜0.001）。（見圖3）

圖3 RT?PCR 檢測SW480 細(xì)胞中CLDND1 基因干擾效果Fig.3 RT?PCR was used for detecting CLDND1 gene interference effect in SW480 cells

2.5 MTT 實驗顯示CLDND1 表達(dá)降低能抑制細(xì)胞生長 把呈對數(shù)生長期的SW480 細(xì)胞分為4 組：（1）Control：單加轉(zhuǎn)染試劑組；（2）Negative Control：轉(zhuǎn)染陰性對照RNA 組；（3）OligoB1：轉(zhuǎn)染單鏈反義寡核苷酸OligoB1 組；（4）OligoB2：轉(zhuǎn)染單鏈反義寡核苷酸OligoB2 組。然后取轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染12、24、36、48 和60 h 六個時間點加入MTT，測定吸光度反映細(xì)胞活力。如圖4所示，OligoB1 和OligoB2 細(xì)胞組增殖能力逐漸下降，明顯低于對照組。

圖4 MTT 檢測顯示抑制CLDND1 基因表達(dá)會降低細(xì)胞增殖能力Fig.4 MTT assay showed that inhibition of CLDND1 gene decreased cell proliferation

2.6 細(xì)胞流式技術(shù)顯示CLDND1 表達(dá)降低能促進細(xì)胞凋亡 細(xì)胞分為4 組：1.Control 單加了轉(zhuǎn)染試劑組；2.Negative control 轉(zhuǎn)染陰性對照RNA 組；3.OligoB1 轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸OligoB1 組；4.OligoB2轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸OligoB2 組。如圖5所示：圖中四個象限分別為UL：死亡細(xì)胞；UR：晚期凋亡細(xì)胞；LL：活細(xì)胞；LR：早期凋亡細(xì)胞。比較4 組凋亡率，統(tǒng)計結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=434.878，P＜0.001），以Control 組為基準(zhǔn)多重比較結(jié)果顯示，NC 組與C 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.830），B1組、B2 組與C 組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）。見圖5。

圖5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測CLDND1 基因表達(dá)降低后細(xì)胞凋亡情況Fig.5 Cell apoptosis was detected by flow cytometry after reduced expression of CLDND1 gene

3 討論

CRC 通常由良性腫瘤即管狀腺瘤或鋸齒狀息肉進展而來，所以它也是最可能預(yù)防的癌癥。息肉-結(jié)直腸癌惡變過程牽涉許多相關(guān)因素，CRC 發(fā)生的基本特征是基因或表觀遺傳的不穩(wěn)定［10］。新近研究表明，LncRNAs 的異常表達(dá)與CRC 的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)。OKUGAWA等［11］研究結(jié)果顯示lncRNA 基于CCAT1 的特異核酸肽信標(biāo)可以輔助CRC 的診斷和判斷手術(shù)指征。有科學(xué)家利用生物信息學(xué)方法結(jié)合內(nèi)源競爭RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA）假說推演了結(jié)直腸癌中特異性lncRNA?miRNA?mRNA 的表達(dá)模式，并構(gòu)建了一個lncRNA 相關(guān)的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，從而肯定了lncRNA 在結(jié)直腸癌發(fā)病分子機制中的重要地位［12］。

本文通過qRT?PCR 在收集的結(jié)直腸病例標(biāo)本中檢測到CLDND1 在癌組織中的RNA 表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)癌旁組織，預(yù)示其可能可以作為診斷CRC 的分子標(biāo)志物。利用重組質(zhì)粒上調(diào)SW480 細(xì)胞中CLDND1 的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，SW480 細(xì)胞活力明顯高于對照組（圖2）。利用RNA 干擾技術(shù)下調(diào)CLDND1 在細(xì)胞中的RNA 水平后，SW480 細(xì)胞的增殖能力明顯低于對照組，這種現(xiàn)象在干擾24 h 后效果顯著（圖3）。經(jīng)檢測，CLDND1 轉(zhuǎn)錄被明顯下調(diào)后，SW480 被誘導(dǎo)發(fā)生凋亡（圖4）。細(xì)胞凋亡的啟動是細(xì)胞在感受到相應(yīng)的信號刺激后胞內(nèi)一系列控制開關(guān)的開啟或關(guān)閉，不同的外界因素啟動凋亡的方式不同，所引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也不相同，CLDND1 具體在哪一種信號通路中參與了細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控也將是我們下一步工作的研究重點。另外，實驗中設(shè)計的針對CLDND1 的兩條反義RNA 能有效干擾結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 中CLDND1 轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，并誘導(dǎo)SW480 細(xì)胞發(fā)生凋亡。這些結(jié)果顯示通過下調(diào)CLDND1 的轉(zhuǎn)錄可能是CRC 治療的一種基因治療方法。

本文首次描述了CLDND1 RNA 與CRC 發(fā)生發(fā)展之間存在密切的相關(guān)性，為進一步探討CLDND1 RNA 對CRC 的影響及CRC 診斷標(biāo)志物的尋找乃至新治療靶點的研究提供了理論依據(jù)。